15.32. XÁC ĐỊNH NITROGEN TRONG VẮC XIN VÀ SINH PHẨM

 

Nguyên lư

Phương pháp dựa vào tính chất của thuốc thử Nessler cho phản ứng màu với ion amoni (NH4+) được tạo thành sau khi vô cơ hoá các chất protein.

 

Phương pháp tiến hành

a. Chuẩn bị mẫu thử:

Cho 1ml chế phẩm và 1ml dung dịch acid tricloracetic 20% (TT) vào một ống ly tâm 10ml, để ở nhiệt độ 4 đến 8 oC trong 10 đến 12 giờ. Sau đó ly tâm 3500 ṿng/phút trong 1 giờ, loại bỏ nước nổi. Rửa tủa bằng 2ml dung dịch acid tricloracetic 5%, tiếp tục ly tâm 3500 ṿng/phút trong 1 giờ, loại bỏ nước nổi. Thêm vào cặn 0,2ml  acid sulfuric đậm đặc (TT) đem vô cơ hoá trên bếp cát cho đến khi dung dịch mất màu. Để tăng tốc độ phản ứng thỉnh thoảng cho vài giọt dung dịch oxy già (H2O2) đậm đặc vào ống đốt sau khi làm nguội. Khi chế phẩm đă được vô cơ hoá hoàn toàn, dung dịch mất màu, thêm  nước cất 2 lần vào đủ 10ml, thu được dung dịch A.

Lấy 1ml dung dịch A vào ống nghiệm, thêm 8,5 ml nước cất 2 lần và 0,5ml thuốc thử Nessler, được mẫu thử.

b. Song song tiến hành làm mẫu trắng gồm: 9,5ml nước cất 2 lần và 0,5ml thuốc thử Nessler.

c. Song song tiến hành dựng đường chuẩn:

Hút dung dịch amoni sulfat chuẩn có hàm lượng 0,05 mg nitrogen/ml vào các ống nghiệm theo thứ tự sau: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 ml. Thêm nước cất 2 lần vừa đủ 9,5 ml và 0,5 ml thuốc thử Nessler.

Lắc đều các ống nghiệm.

Đo mật độ quang (Phụ lục 4.1) ở bước sóng 420 nm.

Vẽ đồ thị đường chuẩn.

Lượng nitrogen protein trong chế phẩm được tính theo công thức sau:

       

Trong đó:

a:                     Lượng nitrogen t́m được trên đường chuẩn (mg).

6,25:                Hệ số chuyển đổi nitơ thành protein.

10:                   Độ pha loăng dung dịch vô cơ hóa (ml).

1,0:                  Lượng mẫu thử đem so màu (ml).

1,0:                  Lượng mẫu thử đem tủa rồi vô cơ hóa (ml).

1000:               Hệ số chuyển mg thành mg.

Cách pha dung dịch amoni sulfat chuẩn có hàm lượng nitrogen 0,05mg/ml

Cân 0,2375g amoni sulfat (đă được sấy khô trong b́nh hút ẩm bằng silicagel đến trọng lượng không đổi), hoà tan vào vừa đủ 500 ml nước cất 2 lần. Dung dịch vừa pha có hàm lượng nitrogen 0,1mg/ml, trước khi dùng pha loăng gấp đôi bằng nước cất 2 lần.

 

Tiêu chuẩn cho phép

Hàm lượng nitrogen protein trong vắc xin và sinh phẩm tùy theo yêu cầu đối với từng loại mẫu thử.