15.29. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG THIMEROSAL TRONG VẮC XIN VÀ SINH PHẨM

 

Có 3 phương pháp để xác định hàm lượng thimerosal trong vắc xin và sinh phẩm. Tùy theo khả năng hiện có về thiết bị và hóa chất tại cơ sở để chọn 1 trong 3 phương pháp thử nghiệm sau đây: phương pháp đo quang phổ, hóa học và phương pháp vi sinh vật.

 

Phương pháp hóa lư

Nguyên lư

Dựa vào phản ứng giải phóng ion thủy ngân tự do từ thimerosal, kết hợp với dithizon thành dithizon-thủy ngân, xác định bằng cách so màu.

Cách tiến hành

Làm song song 2 mẫu (mẫu vắc xin thử và mẫu chứng nước cất), lấy 0,2 ml mỗi mẫu cho vào từng b́nh nút mài riêng biệt có dung tích 100 ml.

Cho vào mỗi b́nh 1,2 ml  acid sulfuric đậm đặc (TT), pha loăng 2 lần tính theo thể tích và đun nhẹ b́nh số 1 (chứa mẫu vắc xin thử) trong cách thủy cho đến khi tan hết. Thêm vào mối b́nh 5 ml dung dịch kali permanganat 5% (TT), lắc đều và để yên trong 1 giờ.

Loại bỏ kali permanganat thừa bằng cách thêm 1,5 ml dung dịch hydroxylamin clorid 10% (TT), thêm 35ml nước cất 2 lần, 5 ml dung dịch acid acetic 6 M (TT) và trộn đều. Dùng buret thêm chính xác vào mỗi b́nh 10 ml dung dịch dithizon 0,001%  và lắc 30 giây.

Chuyển toàn bộ dung dịch thử của từng b́nh vào mỗi b́nh lắng gạn riêng biệt, tách lớp cloroform qua một lớp bông đă hấp và sấy khô vào các ống nghiệm. Đo mật độ quang ( Phụ lục 4.1) ở bước sóng 580 ± 10 nm (kính lọc màu da cam) hoặc bước sóng 597 ± 10 nm (kính lọc màu đỏ).

Hàm lượng thimerosal (μg/ml) có trong vacxin thử được tính theo công thức:

                         a x 100

X=                                           =  a  x  10,1

                         0,2 x 49,55

Trong đó:    a               : lượng thủy ngân (μg) xác định được theo đường chuẩn.

                   0,2                        : số ml dung dịch vắc xin thử

                   49,55        : hàm lượng thủy ngân có trong 100 phần của thimerosal

Cách dựng đường chuẩn

Cân chính xác 0,5 g thủy ngân, ḥa vào 15 ml acid nitric đậm đặc (TT) và thêm nước cất vừa đủ 500 ml, được dung dịch thủy ngân có hàm lượng 1 mg/ml (DD*). Xác định hàm lượng thủy ngân như sau: Lấy 10 ml DD*, cho thêm 10 giọt dung dịch  phèn  sắt amoni 10% và chuẩn độ từ từ  với dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N (CĐ) cho đến khi xuất hiện màu da cam.

1 ml dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N (CĐ) tương đương với 0,001- 0,003 g thủy ngân.

Lấy 5 b́nh nút mài có dung tích 100 ml để tiến hành song song 5 thí nghiệm với 5 mẫu: 0,4 ml, 0,6 ml, 0,8 ml, 1,0 ml, 1,2 ml dung dịch thủy ngân chuẩn trên. Thêm vào mỗi b́nh 1,2 ml  acid  sulfuric đậm đặc (TT) đă pha loăng 2 lần và 3 ml nước cất 2 lần. Nếu không có nước cất 2 lần th́ sử dụng nước xử lư dithizon như sau: Cho vào mỗi b́nh gạn 10 ml dung dịch dithizon (TT) (0,01 g ditizon/1 lít nước), sau đó tách phần cloroform ra. Nếu màu của dithizon thay đổi th́ làm đi làm lại vài lần cho đến khi màu của dithizon không thay đổi. Thêm 5 ml dung dịch natri clorid 0,9% (TT) và 5 ml dung dịch acid acetic 6 M (TT) và tiến hành tiếp tục như đối với mẫu kiểm tra ghi ở phần trên. Các kết quả thu được cho phép lập một đường chuẩn về thủy ngân.

Cách pha dung dịch dithizon 0,001%

- Cân chính xác 10 mg dithizon ḥa tan vào cloroform (TT) và thêm vừa đủ 100 ml với cùng dung môi..

- Bảo quản dung dịch ở chỗ tối 4 – 8 oC trong ṿng 1 tháng. Trước khi dùng pha loăng 10 lần.

 

 Phương pháp vi sinh vật

Nguyên lư

Phương pháp thực hiện dựa trên sự h́nh thành ṿng ức chế kháng khuẩn được tạo bởi dung dịch thimerosal chuẩn và thimerosal có trong mẫu thử; so sánh đường kính ṿng ức chế kháng khuẩn.

Cách tiến hành

Pha thạch thường, đun nóng chảy hoàn toàn và đổ thạch dày 4 mm lên một phiến kính h́nh chữ nhật phẳng. Để thạch nguội hoàn toàn, đục lỗ thạch (đường kính 8 mm) sao cho khoảng cách giữa các lỗ thạch ít nhất là 30 mm. Cấy chủng Staphylococcus aureus trên thạch nghiêng, ủ ở 37 oC/18 - 24 giờ. Gặt và pha vi khuẩn bằng nước muối sinh lư vô khuẩn thành huyền dịch 109 vi khuẩn/ml. Láng đều huyền dịch vi khuẩn (0,5 ml/đĩa thạch) trên đĩa thạch đă đục lỗ. Nhỏ vào mỗi lỗ 100 ml dung dịch thimerosal chuẩn chứa 1 g thimerosal/1lít ở các độ pha loăng 1/2,5, 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160. Ủ ở 37 oC/24 giờ.

Đọc kết quả

Đo đường kính các vùng ức chế vi khuẩn mọc của các đậm độ thimerosal chuẩn, xây dựng đường chuẩn. Dựa vào đường chuẩn và đường kính vùng ức chế của vắc xin mẫu thử để tính ra hàm lượng thimerosal có trong vắc xin mẫu thử.

Tiêu chẩu chấp thuận

Hàm lượng thimerosal trong mỗi vacxin và sinh phẩm có thể khác nhau tùy theo yêu cầu cụ thể, nhưng không được thấp hơn hàm lượng cho thấy có khả năng kháng khuẩn và không cao hơn 115% hàm lượng thimerosal ghi trên nhăn.Yêu cầu chung cho hàm lượng thimerosal trong các vắc xin và sinh phẩm có sử dụng thimerosal làm chất bảo quản đều không được vượt quá 0,02 g%.