15.24.  XÁC ĐỊNH CÔNG HIỆU THÀNH PHẦN HO GÀ TOÀN TẾ BÀO TRONG  VẮC XIN PHỐI HỢP, HẤP PHỤ

 

Công hiệu của vắc xin ho gà trong vắc xin DTP được xác định bằng cách so sánh liều hữu hiệu 50% (ED50) của vắc xin mẫu chuẩn so với vắc xin mẫu thử. Kết quả được tính bằng phương pháp Probit analysis (phần mềm WHO program).

Pha vắc xin

Vắc xin mẫu chuẩn

Lấy một ống vắc xin mẫu chuẩn, hoàn nguyên bằng nước muối sinh lư vô khuẩn và tiếp tục pha loăng tuỳ theo số đơn vị ghi trên nhăn, dùng nước muối sinh lư pha thành ít nhất 3 độ pha loăng bậc 5 thành các độ pha sao cho sau khi thử thách ED50 nằm giữa 3 độ pha loăng, ví dụ theo sơ đồ dưới đây:

A  = 1/30         =          1 ống mẫu  chuẩn        +          30 ml NMSL

B  = 1/150        =          5 ml     A                     +          20 ml NMSL

C  = 1/750        =          5 ml     B                      +          20 ml NMSL

Vắc xin DTP mẫu thử

A = 1/5                        =          5 ml vắc xin mẫu thử   +          20 ml NMSL

B = 1/ 25          =          5 ml dung dịch A         +          20 ml NMSL

C = 1/125         =          5 ml dung dịch B         +          20 ml NMSL

 

Tiêm miễn dịch

Chọn chuột nhắt trắng có trọng lượng 14 - 18 g, nhưng các chuột trong một thử nghiệm không được chênh lệch trọng lượng quá 4g. Dùng chuột cùng giới, nếu khác giới phải chia đều số chuột đực, cái vào các nhóm và nhốt riêng.

Chuột được tiêm miễn dịch sau khi đă được ăn uống đầy đủ 1 giờ. Tiêm ổ bụng 0,5 ml/1 chuột. Mỗi độ pha vắc xin tiêm cho một nhóm chuột, số lượng chuột trong mỗi nhóm tuỳ theo kết quả thẩm định thử nghiệm nhưng không được ít hơn 20 chuột. Tiêm miễn dịch theo thứ tự từ độ pha loăng nhất (từ độ pha C đến A) cho cả loạt vắc xin mẫu thử và mẫu chuẩn.

Bốn nhóm chuột đối chứng: mỗi nhóm 10 con, được nuôi song song với nhóm chuột miễn dịch dùng để kiểm chứng độc lực của chủng thử thách.

Trong thời gian miễn dịch (14 - 17 ngày), chuột phải khoẻ và tăng trọng b́nh thường, ít nhất 94% số chuột đă được MD ở mỗi độ pha của cả vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin thử nghiệm phải được sống sót cho đến ngày thử thách.

 

Tiêm thử thách

Sau 14 - 17 ngày miễn dịch, chuột được thử thách với chủng B. pertussis 18323. Chủng thử thách có thể dùng chủng tươi hoặc chủng ở dạng huyền dịch (10 tỷ vi khuẩn ho gà) được bảo quản trong nitơ lỏng. Chủng thử thách được pha trong dung dịch casein 1%. LD50 của chủng thử thách phải nằm trong khoảng 100 - 1000 vi khuẩn (vk).

Cách pha dung dịch casein 1%

Hoà tan 10 g bột casein 1% trong 1000 ml nước cất 2 lần, cho thêm 2,3 g NaCl. Điều chỉnh đến pH 7 - 7,2 bằng dung dịch NaOH hoặc HCl loăng. Hấp 121 0 C trong 30 phút.

Dung dịch casein 1% phải được kiểm tra an toàn bằng cách tiêm vào năo cho 5 chuột nhắt, mỗi con 0,02 ml. Theo dơi 3 ngày, toàn bộ chuột thí nghiệm phải sống. Nếu có 1 chuột chết phải pha lại dung dịch.

Cách pha hỗn dịch vi khuẩn để kiểm tra liều LD50 và để thử thách

Chủng B.pertussis 18323 được cấy truyền đời 2 hoặc đời 3 trên môi trường Bordet - Gengou có chứa 15% máu cừu hoặc ngựa, huyền dịch vi khuẩn ho gà gặt từ nuôi cấy 20 – 22 giờ được dùng để pha thành hỗn dịch thử thách hoặc sử dụng huyền dịch vi khuẩn ho gà đậm độ 10 tỷ vi khuẩn/ml đă bảo quản trong nitrogen lỏng để pha dung dịch thử thách. Trong khi pha cũng như trong khi tiêm thử thách, hỗn dịch vi khuẩn ho gà phải giữ trong đá lạnh. Thời gian bắt đầu pha đến khi tiêm xong hỗn dịch vi khuẩn thử thách không được quá 150 phút. Xác định đậm độ vi khuẩn ho gà bằng mắt thường khi so với ống độ đục chuẩn quốc tế 10 IOU hoặc đo OD bằng máy quang phổ kế để tính số vi khuẩn ho gà trong hỗn dịch gặt. Pha loăng huyền dich vi khuẩn ho gà bằng casein 1% để có nồng độ là 10 x10 9 vi khuẩn /ml. (*). Nếu sử dụng chủng ho gà được bảo quản trong nitơ lỏng th́ phải làm tan băng nhanh trước khi thử thách. Các độ pha loăng của chủng ho gà được pha theo sơ đồ dưới đây trong dung dịch casein 1%:

Ví dụ:

                  Chủng B. pertussis 18323 giữ trong nitrogen  lỏng là 10. 10 9 /ml ( * ) = A0

A1

=

5.10 9 /  ml

=

1 ml A0

+

1ml  đệm Casein 1%

A2

=

5.10 9 / 2 ml

=

1ml A1

+

1ml đệm Casein 1%

A3

=

5.10 6/ 0,02 ml

=

1ml A2

+

9 ml đệm Casein 1%

A4

=

5.10.5/ 0,02 ml

=

1ml A3

+

9 ml đệm Casein 1%

A5

=

100.000/0,02 ml

=

3 ml A4

+

12 ml đệm Casein 1%

A6

=

10.000/0,02 ml

=

1ml A5

+

9 m Casein 1%l đệm

A7

=

 2000/0,02 ml

=

1ml A6

+

4 ml đệm Casein 1%

A8

=

400/0,02 ml

=

1ml A7

+

4 ml đệm Casein 1%

A9

=

80/0,02 ml

=

1ml A8

+

4 ml đệm Casein 1%

 

Tiêm chuột

Sau 14-17 ngày, toàn bộ chuột đă miễn dịch bởi vắc xin mẫu chuẩn và mẫu thử được tiêm thử thách vào năo, mỗi con nhận 0,02 ml hỗn dịch chứa 100.000 vi khuẩn (độ pha A5) bằng 1 bơm tiêm bán tự động Hamilton.

Nhóm chuột đối chứng, mỗi nhóm 10 con được tiêm với các độ pha từ A6 – A9 tương ứng với hỗn dịch chứa 10.000 vi khuẩn ; 2000 vi khuẩn  ; 400 vi khuẩn   và 80 vi khuẩn .

Độ pha hỗn dịch chứa 80 vi khuẩn sẽ được cấy ít nhất trên 2 đĩa thạch Bordet Gengou sau khi pha xong hỗn dịch và sau khi kết thúc tiêm thử thách. Ủ đĩa thạch ở 35 0 C  trong 3 - 4 ngày, đếm số khuẩn lạc mọc. Thông thường số khuẩn lạc đạt khoảng 30 %.

Cần lưu ư:

- Trong quá tŕnh pha và tiêm thử thách, dung dịch chủng phải luôn giữ trong đá lạnh.

- Thời gian tính từ khi bắt đầu pha chủng đến khi kết thúc thử nghiệm không được quá 2,5 giờ.

- Tất cả vật liệu chứa chủng ho gà đều phải tiệt trùng bằng nồi hấp 121 0C/15-20 phút hoặc luộc sôi trong 30 phút trước khi rửa dụng cụ.

- Những chuột chết trong 3 ngày đầu sau tiêm thử thách được coi là chuột chết không mang tính đặc hiệu của ho gà. Do đó chỉ những chuột chết từ ngày thứ 4 đến ngày 14 mới được tính kết quả.

- Ngày thứ 14 sau thử thách: Tất cả những chuột chết, hay có dấu hiệu liệt rơ và sưng phồng tấy đầu đều được tính là chuột chết.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Tính kết quả

Dựa vào số chuột sống sót trong mỗi nhóm chứng, dùng phương pháp Reed Muench để tính  LD50 của chủng thử thách.

Xem ví dụ dưới đây:

 

Số

Vi khuẩn

Số

Chuột

Số

Sống

Số

Chết

Số tích lũy

Tổng số

% chết

Sống

Chết

10 000

2 000(B)

400(A)

80

10

10

10

10

1

3

6

8

9

7

4

2

1

4

10

8

22

13

6

2

23

17

16

20

95

76(b)

37(a)

10

 

Theo thí dụ trên, LD50 nằm trong khoảng giữa 2 liều 2000 và 400 vi khuẩn, số % chuột chết tương ứng với liều sát trên 50% là 76%, số % chuột chết tương ứng liều sát dưới 50% là 37%

Tính LD50 theo công thức sau :

                                 50 -  a

Log LD 50 = Log A [ -------- ] x Log 5

                                 b  - a

Trong đó:

A :  Liều gây chết vừa sát dưới 50% ( trong thí dụ trên là 400 )

a :% chết tương ứng với A ( trong thí dụ trên là 37% )

B - Liều gây chết vừa sát trên 50% ( trong thí dụ trên là 2000)

b :% chết tương ứng với B ( trong thí dụ trên là 76% )

Thay bằng con số cụ thể là:

                                    50 -  37

Log LD 50 = Log 400 [ ------------ ] x log 5

                                     76 -  37

                 LD50 = 680 vi khuẩn

Dùng phương pháp Probit analysis của chương tŕnh phần mềm WHO program để tính công hiệu của vắc xin ho gà.

Thử nghiệm được coi là có giá trị khi:

- ED50 của vắc xin chuẩn và ED50 vắc xin thử nghiệm nằm giữa độ pha loăng nhất và độ pha đặc nhất của các vắc xin đó.

- Trong suốt thời gian miễn dịch cho đến ngày thử thách số chuột trong mỗi độ pha không được chết quá 6%.

- Liều thử thách phải chứa 100 – 1000 LD50, như vậy liều LD50 phải chứa 100 - 1000 vi khuẩn.

- Thử nghiệm phải đạt đựơc tiêu chuẩn của chương tŕnh Probit Analysis đặt ra về đường thẳng và đường song song của mối tương quan đáp ứng liều.

Nếu kết quả công hiệu thành phần ho gà trong vắc xin DTP hấp phụ không đạt yêu cầu, thử nghiệm phải được nhắc lại:

- Nếu lần 1 không đạt yêu cầu công hiệu và thử nghiệm không có giá trị (invalid test) th́ chỉ cần nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu bằng lần 1. Kết quả lần thử nghiệm nhắc lại nếu đạt yêu cầu th́ loạt vắc xin đó được coi như đạt công hiệu thành phần ho gà. Nếu kết quả không đạt yêu cầu th́ loạt vắc xin đó phải bị huỷ bỏ.

- Nếu thử nghiệm lần 1 không đạt yêu cầu nhưng thử nghiệm có giá trị (valid test) th́ phải nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu gấp đôi. Trong trường hợp này loạt vắc-xin chỉ đạt được yêu cầu về công hiệu khi kết quả trung b́nh nhân của tất cả các thí nghiệm công hiệu có giá trị không thấp hơn tiêu chuẩn cho phép.

Tiêu chuẩn chấp thuận

Vắc xin đạt yêu cầu nếu công hiệu không ít hơn 4 IU trong 1 liều đơn vắc xin cho người và giới hạn dưới của 95 % khoảng tin cậy của công hiệu t́m được không ít hơn 2 IU trong 1 liều đơn vắc xin cho người.