15.21. XÁC ĐỊNH CÔNG HIỆU CỦA VẮC XIN BẠI LIỆT UỐNG

 

Xác định công hiệu (hiệu giá) của vắc xin bại liệt uống gồm 2 nội dung:

- Xác định hiệu giá virus trong vắc xin bán thành phẩm (đơn tưp).

- Xác định hiệu giá virus trong vắc xin thành phẩm (tam liên).

 

Xác định hiệu giá virus trong vắcxin bán thành phẩm (đơn tưp)

 

Nguyên tắc

Công hiệu của vắc xin pḥng bại liệt uống được xác định bởi liều gây huỷ  hoại 50% tế bào cảm thụ Hep-2 Cincinnati (CCID50) trong phương pháp vi lượng.

 

Vật liệu

Trypsin 0,25%.

Môi trường nuôi cấy và duy tŕ tế bào.

Vắc xin bán thành phẩm cần thử

Vắc xin mẫu chuẩn đơn giá.

Phiến nhựa 96 giếng đáy bằng và các loại dụng cụ vô trùng khác.

Tế bào Hep-2 (Cincinnati)

Pipet các loại.

 

Tiến hành

Pha loăng bậc 10 mẫu chuẩn và vắc xin cần thử từ 10-1 đến 10-8 bằng môi trường duy tŕ tế bào.

Cho 0,1ml các đậm độ virus vào mỗi giếng của phiến nhựa, mỗi đậm độ dùng từ 8 đến 10 giếng.

Cho  0,1 ml hỗn dịch tế bào chứa 1.104 tế bào Hep-2 vào mỗi giếng.

Đậy nắp phiến nhựa và cho các phiến nhựa vào tủ CO2, nhiệt độ nuôi cấy là 36 0C trong 7 ngày.

Theo dơi

Theo dơi sự huỷ hoại của tế bào từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7.

Tính kết quả

Đọc kết quả cuối cùng vào ngày thứ 7 và xử lư số liệu theo phương pháp thống kê Reed-Muench hoặc Karber

Thí nghiệm có giá trị nếu hiệu giá của vắc xin mẫu chuẩn sai số trong ṿng 0,5 log10 so với hiệu giá đă biết.

 

Xác định hiệu giá của vắc xin bại liệt uống trong thành phẩm tam liên

 

Nguyên tắc

Vắc xin bại liệt uống tam liên bao gồm 3 tưp virus bại liệt sống giảm độc, do đó cần xác định hiệu giá của từng tưp thành phần (tưp 1, tưp 2, tưp 3) và hiệu giá tổng cả 3 tưp (tưp1+ tưp2 + tưp3). Muốn chuẩn độ hiệu giá của từng tưp  phải dùng kháng huyết thanh (KHT) đặc hiệu để trung hoà 2 tưp c̣n lại. Hiệu giá của vắc xin Sabin được tính bằng lượng virus Sabin gây huỷ hoại 50% tế bào cảm thụ trong 1 liều dùng cho người CCID50/0,1ml  (CCID50 Cell Culture Infective Dose).

Vật lịệu

Môi trường nuôi cấy và duy tŕ tế bào.

Trypsin 0,25%

Vắc xin mẫu chuẩn tam liên.

Vắc xin thành phẩm tam liên cần thử.

Phiến nhựa 96 giếng đáy bằng và các dụng cụ vô khuẩn khác.

Tế bào Hep2 (Cincinnati).

Kháng huyết thanh polio tưp 1, 2, 3 pha theo hiệu giá.

Pipet các loại.

Các bước tiến hành

Pha loăng bậc 0,5 log10 vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin thử bằng môi trường duy tŕ.

Pha hỗn dịch kháng huyết thanh số 1 chứa kháng huyết thanh tưp 2 và tưp 3.

Pha hỗn dịch kháng huyết thanh số 2 chứa kháng huyết thanh tưp 1 và tưp 3.

Pha hỗn dịch kháng huyết thanh số 3 chứa kháng huyết thanh tưp 1 và tưp 2.

Cho 0,05 ml/ giếng hỗn dịch kháng huyết thanh số 1 vào phiến số 1 (xác định hiệu giá tưp 1).

Cho 0,05 ml/ giếng hỗn dịch kháng huyết thanh số 2 vào phiến số 2 (xác định hiệu giá tưp 2).

Cho 0,05 ml/ giếng hỗn dịch kháng huyết thanh số 3 vào phiến số 3 (xác định hiệu giá tưp 3).

Cho 0,05 ml/ giếng môi trường duy tŕ vào tất cả các giếng của phiến số 4 (xác định hiệu giá tổng).

Cho 0,05 ml của từng độ pha loăng vắc xin vào các dăy tương ứng của cả 4 phiến, mỗi độ pha loăng gây nhiễm 8 giếng. Bắt đầu gây nhiễm từ độ pha loăng cao nhất.

Thêm 0,05 ml môi trường duy tŕ vào các giếng chứng huyết thanh (SC - serum control) và chứng tế bào (CC- cell control).

Đậy nắp phiến cho vào tủ ấm CO2. Trong trường hợp để tủ ấm thường th́ gói kín trong giấy bạc hoặc trong túi nilông.

Ủ ở nhiệt độ 36 0C trong ṿng 3 giờ để virus và kháng huyết thanh đặc hiệu kết hợp với nhau.

Chuẩn bị hỗn dịch tế bào Hep-2 nồng độ 1-2 x105/ ml rồi cho 0,1 ml hỗn dịch này vào toàn bộ các giếng của cả 4 phiến. Nồng độ này thường đảm bảo tế bào sẽ mọc thành 1 lớp trên phiến trong ṿng 2-3 ngày.

Đậy nắp phiến rồi cho vào tủ ấm CO2. Trong trường hợp để ở tủ ấm thường th́ dán kín bằng màng dán phiến (microtest film).

Ủ ở 36 OC trong 7 ngày.

Theo dơi và tính kết quả

Theo dơi sự huỷ hoại của tế bào và tính kết quả như đă tŕnh bầy ở phần trên. Tế bào ở các giếng chứng huyết thanh và chứng tế bào phải phát triển tốt.

Vắc xin thành phẩm coi như đạt yêu cầu nếu:

Tưp 1 có ít nhất 106,0 CCID50/0,1ml

Tưp 2 có ít nhất 105,0 CCID50/0,1ml

Tưp 3 có ít nhất 105,5 CCID50/0,1ml

Toàn bộ qui tŕnh xác định công hiệu của vắc xin bại liệt uống phải được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn.