15.10. THỬ NGHIỆM NHẬN DẠNG HUYẾT THANH MIỄN DỊCH

 

Mục đích của thử nghiệm nhận dạng huyết thanh miễn dịch là nhằm khẳng định huyết thanh thử nghiệm chỉ chứa protein từ loài động vật đăng kí trong sản xuất.

Có thể tiến hành theo 1 trong 2 kỹ thuật sau:

Kỹ thuật khuếch tán miễn dịch (Ouchterlony)

Nguyên lư

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lư khuếch tán kép tự do của kháng nguyên và kháng thể từ các giếng riêng biệt được tạo trong gel agarose 1% vào môi trường và tạo thành cung tủa do phản ứng đặc hiệu của chúng.

Vật liệu và thiết bị

Phiến kính

Agarose 1% trong đệm phosphat pH 7,4.

Hộp ẩm

Huyết thanh miễn dịch thử nghiệm

Huyết thanh kháng loài

Dung dịch nhuộm: Coomasie blue 0,025%

Dung dịch tẩy màu: Methanol: Acetic acid: Nước cất (4:1:5)

Tiến hành

Đổ gel agarose 1% lên phiến kính.

Dùng dụng cụ đục giếng loại có đường kính 3 mm tạo 7 giếng trên phiến kính (1 giếng ở giữa, 6 giếng cách đều xung quanh). Nhỏ huyết thanh kháng loài vào các giếng xung quanh và huyết thanh thử nghiệm vào giếng ở giữa.

Đặt phiến kính vào hộp ẩm từ 12 - 48 giờ.

Nhuộm gel với dung dịch nhuộm coomasie blue 0,025%. Tẩy màu bằng dung dịch tẩy màu, sau đó rửa bằng nước cất.

Để khô phiến kính ở nhiệt độ pḥng.

Kỹ thuật điện di miễn dịch

Nguyên lư

Dưới tác động của điện trường và trong môi trường gel agarose, kháng nguyên tích điện âm từ giếng ở phía cực âm và kháng thể tích điện dương từ giếng ở phía cực dương sẽ di chuyển ngược chiều nhau, khi gặp nhau sẽ h́nh thành đường tủa có thể nh́n thấy được.

Vật liệu và thiết bị

Phiến kính

Thạch 3% trong nước cất

Agarose 1,5% trong đệm barbital pH 8,4

Huyết thanh miễn dịch thử nghiệm.

Huyết thanh kháng loài.

Máy điện di, nguồn điện.

Dung dịch nhuộm, rửa, tẩy màu....

Tiến hành

Đổ thạch nền 3% lên phiến kính.

Đổ agarose 1,5% lên trên thạch nền.

Sau khi agarose đông, đục 2 giếng có đường kính 3 mm, khoảng cách giữa 2 giếng là 4-5 mm. Nhỏ huyết thanh thử nghiệm và huyết thanh kháng loài vào mỗi giếng.

Đặt phiến kính vào máy điện di.

Tiến hành điện di ở 10 V/cm từ 10 đến 60 phút tuỳ thử nghiệm.

Ngừng điện di, quan sát kết quả.

Để dễ quan sát đường tủa, cần loại protein không tủa bằng cách ngâm phiến kính trong đệm PBS. Phủ giấy lọc Whatman lên phiến kính và sấy ở 37 oC đến khô.

Nhuộm xanh với Coomasie blue trong 20 phút.

Tẩy màu, rửa với nước cất, để khô.

Nhận định kết quả.

Huyết thanh miễn dịch thử nghiệm được nhận dạng đúng khi xuất hiện đường tủa giữa mẫu thử nghiệm và huyết thanh kháng loài tương ứng.