13.2 Php th ni c t vi khun

 

Php th ni c t vi khun dng pht hin hoc nh lng ni c t ca vi khun gram m c trong mu th cn kim tra. Phng php s dng thuc th lysat l dch phn gii t bo dng amip c trong mu mt loi sam bin, Limulus polyphemus hoc Tachypleus tridentatus.

Hin nay c 3 phng php thc hin php th ny: phng php to gel da trn s to thnh gel khi cho thuc th vo dung dch c cha ni c t; phng php o c, da vo s thay i c ca thuc th lysat khi to gel; phng php o mu da trn s thay i mu ca phc hp mu - peptid.

Tu theo iu kin v tnh cht ca mu th, c th p dng mt trong cc k thut thch hp thc hin php th. Tuy nhin, khi c nghi ng hoc tranh chp, kt lun cui cng s da vo phng php to gel tr khi c ch dn khc.

Php th c thc hin trong iu kin trnh nhim khun.

 

Thit b v dng c:

Tt c dng c dng trong php th ny u phi khng c cha ni c t.

Vi nhng dng c thu tinh hoc bng cht liu chu c nhit, loi cht gy st bng cch sy 250oC trong t nht 30 pht. Nu dng cc dng c l cht do, nh cc u ht ca micropipet hay cc khay l lm phn ng, ch dng cc loi c cht liu khng nh hng ti php th v khng c cha ni c t.

Nc th ni c t (nc BET hoc nc LAL): L nc tinh khit cho kt qu m tnh trong php th ni c t iu kin quy nh. C th dng nc ct 3 ln hoc mt loi nc tinh khit thu c bng phng php thch hp khc t yu cu trn.

Nu khng c ch dn g khc, dng nc BET hoc nc LAL lm dung mi pha tt c cc dung dch dng trong php th.

 

Dung dch acid hydrocloric 0,1M BET v natri hydroxyd 0,1M BET: l dung dch c pha t acid hydrocloric m c hoc natri hydroxid rn vi nc BET trong mt dng c khng c cha ni c t. Cc dung dch ny t yu cu nu sau khi iu chnh n pH 6,0- 8,0, cho kt qu m tnh trong iu kin ca php th.

 

Chun ni c t v dung dch chun gc: chun ni c t c s dng trong php th nh mt cht i chiu. Chun c thit lp v nh gi theo chun ni c t quc t. Hot lc ca chun c biu th theo n v quc t qui nh bi T chc Y t th gii (International Unit = IU) hoc n v ni c t (Endotoxin Unit EU). 1 IU tng ng vi 1 EU.

Dung dch chun gc ni c t c pha theo quy nh ng gi ca tng nh sn xut. Trn nhn v t hng dn s dng km theo ghi r cch pha, iu kin bo qun v s n v ni c t c trong dung dch chun gc sau khi pha theo hng dn.

Pha dung dch chun: Pha dung dch chun gc vi nc BET/ LAL c dy chun c nng thch hp. Trc khi pha, thng yu cu lc mnh dung dch chun gc trong t nht 15 pht, v mi ln pha long, trn cc dung dch pha long t nht 30 giy. Dng cc dung dch chun pha long cng sm cng tt trnh mt hot lc.

 

Dung dch th

Chun b dung dch th bng cch ho tan hoc pha long mu th vi nc BET/ LAL n pha long thch hp. Mt s cht hoc ch phm c th cn phi ha tan hoc pha long trong dung dch thn nc khc. pH ca hn hp phn ng phi nm trong khong qui nh cho mi loi thuc th, thng thng trong khong 6,0 8,0. Do vy, nn iu chnh pH ca dung dch th cho ph hp bng cc dung dch acid hydrocloric 0,1M BET, natri hydroxyd 0,1M BET hoc mt m thch hp theo khuyn co ca nh sn xut thuc th.

Php th khng thch hp vi mt s loi mu th nh cc loi nh dch, hn dch Mt s cht c th cho phn ng dng tnh hoc m tnh gi vi thuc th nh cc ch phm t mu, polynucleotid; ch phm c cha kim loi nng, cht din hot, nng ion cao. Do vy, cn phi kho st, tm phng php x l v nh gi trc khi p dng php th cho ch phm.

 

pha long ti a:

pha long ti a (MVD) l h s pha long ln nht cho php thu c dung dch th c cha lng ni c t c th pht hin c.

MVD c tnh nh sau:

Gii hn ni c t x nng dung dch th

MVD =

l

 

Trong :

Gii hn ni c t (Endotoxin Limit = EL): gii hn ni c t thng c quy nh trong cc chuyn lun ring. Ch phm t yu cu nu lng ni c t c trong ch phm thp hn gii hn qui nh. Gii hn ni c t ca cc ch phm c tnh trn c s liu dng cho ngi theo cng thc sau:

EL = K/ M

 

Trong , K l ngng ni c t tnh cho 1 kg th trng ngi c th chu ng c m khng xy ra phn ng c hi; Gi tr K c tham kho trong bng 1 di y.

M l liu ti a ca sn phm tnh cho 1 kg th trng dng di dng n liu trong thi gian khong 1 gi. Liu ny c hiu l lng thuc ti a c th c dng trong vng 1 gi. Vi cc loi thuc tim di da, tim bp hoc tim tnh mch mt ln s c coi nh dng n liu. Vi cc dch truyn tnh mch trong thi gian di, tnh M theo lng thuc ca liu c th c truyn ti a trong mt gi, da trn tc truyn tiu chun nu khng c qui nh ring no cho ch phm. Gi tr c dng l liu ti a theo khuyn co ca nh sn xut, c th mc liu vt qu mc liu theo ch dn ca thy thuc.

Bng 1:

 

Loi sn phm

K (tnh cho 1 kg th trng)

Cc loi thuc tim trong mng

0,2

Cc thuc phng x tim tnh mch

2,5

Tt c cc thuc tim tr loi tim trong mng hoc thuc phng x

5,0

Nu mt sn phm c th c dng theo c 2 ng tim trong v v cc ng tim khc th gii hn ni c t cho sn phm c tnh theo gi tr K ca ng tim trong v v c yu cu cht ch hn.

Trn thc t, cc nh sn xut thng qui nh gii hn ni c t cho sn phm thp hn nhiu so vi gii hn tnh theo ngng chu ng ca ngi bnh, khi dng liu ti a sn phm vn m bo an ton cho ngi bnh.

 

Nng ca dung dch th:

Tnh bng mg/ ml nu gii hn ni c t trong chuyn lun ring quy nh theo khi lng (IU/ mg)

Tnh bng n v/ ml nu gii hn ni c t trong chuyn lun ring quy nh theo n v hot lc sinh hc (IU/ n v)

Tnh bng ml/ ml nu gii hn ni c t trong chuyn lun ring quy nh theo th tch (IU/ ml)

l : l nhy ca thuc th c ghi trn nhn (k thut to gel) hoc nng ni c t thp nht dng xy dng ng cong chun (phng php o c hoc o mu).

 

phng php to gel

Phng php to gel cho php pht hin hoc xc nh lng ni c t da trn s to gel ca thuc th lysat vi ni c t. Nng ni c t yu cu to gel vi thuc th lysat trong iu kin tiu chun l nhy ghi trn nhn ca thuc th. m bo chnh xc v gi tr ca php th, phi tin hnh php th kim tra khng nh nhy ghi trn nhn ca thuc th lysat v kim tra cc yu t nh hng theo hng dn di y.

 

1, Chun b th

- Kim tra nhy ca lysat

nhy ca thuc th lysat ghi trn nhn l nng ni c t thp nht cn thit to gel vi thuc th trong iu kin xc nh.

Php th kim tra nhy c thc hin mi khi c l thuc th mi hoc khi c s thay i iu kin th nghim c th nh hng ti kt qu ca php th.

Tin hnh:

Chun b cc dung dch ni c t chun vi t nht 4 nng tng ng 2l; l; 1/2l v 1/4l bng cch pha long dung dch chun gc vi nc BET, mi nng cn 4 ng. Trong l l nhy ghi trn nhn ca lysat mun kim tra. Pha thuc th lysat vi nc BET theo hng dn trn nhn. Trn mt th tch thuc th vi ng lng dung dch chun (thng dng 0,1 ml) cho mi ng. cc ng nghim c cha hn hp phn ng 37 1oC trong 60 2 pht, trnh b rung ng mnh.

c kt qu sau mt khong thi gian qui nh. Phn ng dng tnh nu gel to thnh khng b chy ra khi nh nhng dc ngc ng nghim (180o). Phn ng m tnh khi khng to thnh gel hoc gel khng chc, rt d b r khi dc ngc ng nghim.

Php th khng c gi tr nu bt k ng no ca dung dch chun ni c t c nng thp nht (0,25 l) cho phn ng dng tnh. Khi , cn kim tra k li cc iu kin th nghim v lp li th nghim.

im dng l ng cui cng c h s pha long ln nht trong dy cho phn ng dng tnh.

nhy ca thuc th c biu th l trung bnh nhn ca nng im dng (IU/ml), c tnh nh sau: tnh gi tr trung bnh ca cc logarit nng ni c t ti im dng, sau ly i logarit ca gi tr trung bnh.

Trung bnh nhn nng im dng = anti log (Se/ f)

Trong : (Se = tng cc logarit nng im dng ca mi dy th

f = s dy chun ni c t th

 

nhy ghi trn nhn ca thuc th c khng nh l ng nu trung bnh nhn nng im dng ln hn hoc bng 0,5 l v nh hn hoc bng 2,0 l.

 

Kim tra yu t nh hng

Php th c ngha kim tra xem trong mu th c cha cc yu t lm tng hay c ch phn ng hay khng. Khi c bt k s thay i iu kin no c th nh hng n kt qu th nghim, cn thc hin php th ny.

Chun b cc dung dch A, B, C v D theo nh bng 2. Cc iu kin th nghim nh nhit , thi gian v nh gi kt qu tng t nh trong phn Kim tra nhy ca lysat.

Trung bnh nhn nng im dng ca dung dch B v C c xc nh theo hng dn nu trong phn Kim tra nhy ca lysat.

 

Bng 2: Kim tra yu t nh hng

 

Dung dch

Nng ni c t c thm vo mi dung dch

Dung mi

H s pha long

Nng ni c t sau khi pha long

S ng nghim

A

0/ dung dch th

-

-

-

4

B

2l/ dung dch th

dung dch mu th

1

2

4

8

2 l

1 l

0,5 l

0,25 l

4

4

4

4

C

2l/ nc BET

Nc BET

1

2

4

8

2 l

1 l

0,5 l

0,25 l

2

2

2

2

D

0/ nc BET

-

-

-

2

 

Dung dch A (dung dch th): mu th pha pha long MVD

Dung dch B (i chng dng tnh c mu th): ni c t pha trong dung dch th kim tra yu t nh hng.

Dung dch C (khng nh nhy ca lysat): chun ni c t pha trong nc BET vi nng khc nhau.

Dung dch D (i chng m tnh): nc BET

 

Php th c gi tr khi dung dch A v D cho phn ng m tnh v kt qu dung dch C khng nh nhy ca thuc th.

Nu nhy ca lysate tnh theo dung dch B ln hn 0,5 l v nh hn 2,0 l th mu th khng cha yu t nh hng v php kim tra yu t nh hng t yu cu. Nu khng tho mn cc yu cu trn th mu th c cha yu t nh hng ti php th.

Nu mu th khng t pha long nh hn MVD, lm li php th vi pha long ln hn nhng khng qu MVD. S dng thuc th c nhy ln hn s cho php mu th c pha long nhiu hn, khi c th hn ch c yu t nh hng. Ngoi ra, c th x l loi cc yu t nh hng bng phng php thch hp nh lc, trung ho, thm tch hoc un nng. m bo phng php x l chn chc chn loi c yu t nh hng m khng lm mt ni c t, cn thc hin php th Kim tra yu t nh hng vi dung dch th sau khi x l v cho thm chun ni c t. Nu phng php c hiu qu, cn ghi vo tiu chun.

 

2, Php th gii hn

Da trn s to gel ca thuc th lysat vi ni c t, phng php ny kim tra xem lng ni c t c trong mu th c ln hn gii hn qui nh hay khng.

Tin hnh: Chun b dung dch A, B, C v D theo bng 3, mi dung dch 2 ng. Cc iu kin th nghim nh nhit , thi gian v nh gi kt qu tng t nh trong phn Kim tra nhy ca lysat.

 

Bng 3:

Dung dch

Nng ni c t thm vo cho mi dung dch

S ng nghim

A

0/ dung dch th

2

B

2 l/ dung dch th

2

C

2 l/ nc BET

2

D

0/ nc BET

2

 

Trong :

-   Dung dch A (dung dch th): mu th pha pha long MVD

-   Dung dch B (i chng dng tnh c mu th): ni c t pha trong dung dch th.

-   Dung dch C (i chng dng tnh): chun ni c t pha trong nc BET

-   Dung dch D (i chng m tnh): nc BET

 

nh gi kt qu:

Php th c gi tr nu c 2 ng ca dung dch B v C u cho kt qu dng tnh v dung dch D m tnh.

Mu th t yu cu nu kt qu m tnh c hai ng nghim ca dung dch A.

Mu th khng t yu cu nu kt qu dng tnh trn c hai ng nghim ca dung dch A khi pha long bng MVD.

Nu hai ng ca dung dch A cho kt qu khc nhau, mt ng dng tnh v mt ng m tnh th lm li php th. Mu th t yu cu nu ln th th hai c hai ng u cho kt qu m tnh.

 

3, Php th bn nh lng

Php th ny xc nh lng ni c t c trong dung dch mu th bng cch thc hin phn ng tin dn ti im dng trong qu trnh to gel.

Tin hnh: Chun b dung dch A, B, C v D theo bng 4, mi dung dch 2 ng nghim.

Dung dch th dng cho dung dch A v B phi khng c cha yu t nh hng. Cc iu kin th nghim nh nhit , thi gian v nh gi kt qu tng t nh trong phn Kim tra nhy ca lysat.

Bng 4:

 

Dung dch

Nng ni c t c thm vo mi dung dch

Dung mi

H s pha long

Nng ni c t sau khi pha long

S ng nghim

A

0/ dung dch mu th

-

1

2

4

8

-

2

2

2

2

B

2l/ dung dch mu th

Dung dch mu th

1

2 l

 

2

C

2l/ nc BET

Nc BET

1

2

4

8

2 l

1 l

0,5 l

0,25 l

2

2

2

2

D

0/ nc BET

-

-

-

2

-   Dung dch A (dung dch th): dung dch th c pha long MVD, khng c yu t nh hng. Pha mu th vi nc BET theo cc h s pha long 1/2, 1/4, 1/8 ... C th pha long tip c kt qu ph hp nhng h s pha long dung dch th cui cng phi khng qu MVD.

-   Dung dch B (i chng dng tnh c mu th): ni c t pha trong dung dch A, kim tra yu t c ch s to gel.

-   Dung dch C (i chng dng tnh): 2 dy chun ni c t pha trong nc BET

-   Dung dch D (i chng m tnh): dng nc BET

 

Tnh ton v nh gi kt qu:

Php th c gi tr khi tho mn 3 iu kin sau:

a, C 2 ng ca dung dch D u m tnh (i chng m tnh)

b, C 2 ng ca dung dch B u dng tnh (i chng dng tnh c mu th).

c, Trung bnh nhn nng im dng ca dung dch C nm trong khong 0,5l - 2 l

 

im dng c xc nh l ng nghim c h s pha long cao nht trong dy ca dung dch A cho phn ng dng tnh, v nng ni c t im dng ca dung dch A l tch s ca pha long ti im nhn vi h s l.

Nng ni c t trong dung dch mu cn kim tra c xc nh l trung bnh nhn nng im dng ca cc dy th, tnh trung bnh nng ni c t ca 2 dy (tng t nh phn Kim tra nhy ca lysat)

 

Nu khng c nng no ca dung dch A cho phn ng dng tnh, th nng ni c t ca dung dch A nh hn l x h s pha long thp nht ca dung dch A.

Nu tt c cc pha long u cho phn ng dng tnh, nng ni c t ca dung dch A l bng hoc ln hn tch ca h s pha long ln nht ca dung dch A nhn vi l.

C th pha long tip tm c im dng. Tnh nng ni c t ca mu th (EU/ ml, EU/ mg hoc mEq hoc EU/ n v), da trn nng ni c t trung bnh ca dung dch A. Mu th t yu cu php th ny nu nng ni c t c trong mu th thp hn gii hn ni c t qui nh trong chuyn lun ring.

 

 

Phng php o quang

1. Phng php o c

Phng php o c xc nh lng ni c t c trong dung dch mu th da trn o mc thay i c trong qu trnh to gel ca thuc th lysat. Hin nay c 2 k thut c p dng: o c ti im dng hoc o c ng hc.

o c ti im dng da trn s tng quan gia nng ni c t v c ca hn hp phn ng thi im xc nh vo cui ca giai on .

o c ng hc da trn s tng quan gia nng ni c t v thi gian cn thit t ti c nh trc ca hn hp phn ng hoc tc tng c ca hn hp.

Php th thng thc hin 37 1oC, c biu th bng hp th hay truyn qua.

 

2. Phng php o mu

Phng php o mu xc nh nng ni c t ca cc dung dch mu th da trn o cht mu c gii phng ra t mt c cht mang mu do phn ng ca ni c t vi thuc th lysat.

C 2 k thut o: o mu ti im dng hoc o mu ng hc.

o mu ti im dng da trn tng quan gia nng ni c t v m cht mu to thnh ca hn hp phn ng im cui ca giai on .

o mu ng hc da trn mi tng quan nh lng gia nng ni c t v thi gian cn thit hn hp phn ng t ti hp th (hoc truyn qua) nh trc hoc tc tng mu ca hn hp.

Php th thng thc hin 37 1oC.

 

3. Chun b:

m bo ng v gi tr ca phng php o mu hoc o c, phi tin hnh php th Kim tra ng chun v Kim tra yu t nh hng nh sau:

- Kim tra ng chun: Php th c thc hin vi mi l thuc th lysat mi. Dng dung dch ni c t chun, pha t nht 3 nng ni c t to c ng chun trong khong nng ni c t ghi trong hng dn ca thuc th lysat ang s dng. Vi mi nng , phi dng t nht 3 ng tu theo iu kin qui nh cho thuc th lysat ang dng (v t l th tch, thi gian , nhit , pH). *

Gi tr tuyt i ca h s tng quan [r], phi ln hn hoc bng 0,980 cho khong nng ni c t dng.

Nu php th khng c gi tr, kim tra cc iu kin th nghim v tin hnh li nh trn.

Php th Kim tra ng chun phi c thc hin mi khi c thay i mt iu kin no c th nh hng n kt qu th nghim.

 

- Kim tra yu t nh hng: Chn nng ni c t vo khong gia ca ng chun.

Chun b dung dch A, B, C v D theo bng 5. Tin hnh php th vi cc dung dch ny sau khi chun ho cc iu kin theo qui nh ca loi thuc th lysat s dng (v th tch, t l th tch dung dch th v thuc th lysat, thi gian )

Php th Kim tra yu t nh hng phi c thc hin mi khi c s thay i c th nh hng ti kt qu th nghim.

Bng 5:

 

Dung dch

Nng ni c t thm vo mi dung dch

Dung dch c thm ni c t

S ng nghim hoc l phn ng

A

0

Dung dch mu

Khng t hn 2

B

Nng khong gia ca ng cong chun

Dung dch mu

Khng t hn 2

C

t nht 3 nng

Nc BET

Mi nng khng t hn 2

D

0

Nc BET

Khng t hn 2

 

-   Dung dch A (dung dch th): Dung dch mu pha long khng qu MVD

-   Dung dch B: Thm dung dch chun vo dung dch mu th c nng ni c t vo khong on gia ca ng cong chun

-   Dung dch C (i chng dng tnh): dung dch chun ni c t c nng dng trong thm nh phng php nh m t trong phn Kim tra ng chun.

-   Dung dch D (i chng m tnh): dng nc BET

Php th ch c gi tr khi h s tng quan ca ng chun thu c t dung dch C ln hn hoc bng 0,980

Dung dch D phi cho kt qu khng vt qu gii hn gi tr trng theo qui nh ca thuc th lysat dng, hoc thp hn gii hn ni c t pht hin ca lysat dng.

 

Kh nng tm li c lng ni c t chun thm vo dung dch B bng hiu s nng tm thy trong dung dch B tr i nng ni c t tm c trong dung dch A.

Nu kh nng tm li lng ni c t thm vo nm trong khong 50% - 200%, dung dch mu cn kim tra c coi l khng c yu t nh hng.

Nu nng tm li c nm ngoi khong qui nh, dung dch mu cn kim tra c cha yu t nh hng. Khi , cn x l loi yu t nh hng bng cc phng php thch hp (nh nu trong phng php to gel). Sau , phi thc hin nh gi li xem phng php x l c loi c yu t nh hng khng.

 

4, Xc nh lng ni c t trong mu th

- Tin hnh: Chun b dung dch A, B, C v D theo nh bng 5, v theo qui trnh nh m t trong phn Kim tra yu t nh hng.

- Tnh nng ni c t

Tnh nng ni c t trong mi ng ca dung dch A theo ng chun thu c t dung dch C. Php th khng c gi tr tr khi tho mn cc yu cu sau:

1. Gi tr tuyt i ca h s tng quan ca ng chun theo dung dch C ln hn hoc bng 0,980

2. Lng ni c t tm li c, tc l hiu s nng ni c t tm li c trong dung dch B tr i nng ni c t trong dung dch A, phi nm trong khong 50% - 200%.

Kt qu ca dung dch D khng vt qu gii hn gi tr trng ca thuc th lysat dng, hoc phi thp hn gii hn ni c t pht hin ca lysat dng.

nh gi kt qu:

Mu th t php th ni c t vi khun nu nng ni c t ca mu th tnh t nng ni c t trung bnh ca cc ng dung dch A thp hn gii hn ni c t qui nh trong chuyn lun ring.

 

* Nu t s gi tr logarit p ng gia nng cao nht so vi nng thp nht trong khong kho st ln hn 2, th nn thm mt s nng thu c ng chun c khong cch gia cc gi tr log ph hp.