13.10. PHÂN TÍCH THỐNG KÊ KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG SINH HỌC

1. Mở đầu

Chuyên luận này hướng dẫn cách bố trí thí nghiệm và phương pháp phân tích thống kê kết quả của các định lượng sinh học có trong Dược điển Việt Nam.

Có thể dùng kiểu bố trí thí nghiệm và cách tính toán kết quả khác với phương pháp mô tả trong chuyên luận này, miễn sao các phương pháp đó có độ tin cậy tương đương.

Phương pháp sinh học được dùng để định lượng các hợp chất hay chế phẩm mà hoạt lực của chúng không thể xác định một cách chính xác bằng các phương pháp phân tích Hóa - Lư. Nguyên tắc của phương pháp là so sánh chế phẩm cần định lượng với một chất chuẩn để xác định lượng chế phẩm cần định lượng cho cùng tác động sinh học với lượng biết trước, tính bằng đơn vị, của chất chuẩn. Để đảm bảo độ chính xác của kết quả định lượng, mọi thử nghiệm tiến hành với chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng phải thực hiện đồng thời và trong cùng điều kiện thí nghiệm. 

Định lượng sinh học luôn luôn mắc phải sai số ngẫu nhiên do tính biến thiên vốn có của đáp ứng sinh học, do đó nếu có thể, khi tính kết quả của mỗi định lượng phải tính sai số của định lượng, kể cả khi dùng phương pháp chính thức. V́ vậy, trong chuyên luận này có hướng dẫn các phương pháp bố trí thí nghiệm và cách tính sai số cho mỗi kiểu bố trí thí nghiệm tương ứng. Các phương pháp tính toán tŕnh bày ở đây chỉ tính đến sai số ngẫu nhiên gây bởi chỉ thị sinh học và giả định rằng các sai số hệ thống, ví dụ sai số do cân, pha loăng, … là rất nhỏ và không ảnh hưởng đáng kể đến kết quả định lượng (do đó phải có biện pháp thích hợp để giảm sai số hệ thống đến mức có thể chấp nhận được). Trong mọi trường hợp, trước khi áp dụng một phương pháp thống kê bất kỳ, phải tiến hành định lượng sơ bộ một số lần thích hợp để bảo đảm chắc chắn tính khả dụng của phương pháp đó.

Độ chính xác của kết quả định lượng sinh học được xác định bởi các giới hạn tin cậy, c̣n gọi là khoảng tin cậy. Giới hạn tin cậy ở xác suất 95 % thường được sử dụng trong các định lượng sinh học, do đó cũng được chọn trong chuyên luận này. Khoảng tin cậy tính bằng các phương pháp toán thống kê giới thiệu ở đây có khả năng chứa hoạt lực thật của chế phẩm cần định lượng với xác suất 95 %. Một số chuyên luận Dược điển qui định giới hạn tin cậy phải không được vượt quá một ngưỡng nhất định, ví dụ phải nằm trong khoảng từ 95 % đến 105 % so với hoạt lực tính được, trong những trường hợp như vậy, có thể phải lặp lại định lượng hai hay nhiều lần để đạt được giới hạn tin cậy cho phép.

Các thuật ngữ dùng trong chuyên luận này được tŕnh bày ở phần cuối của chuyên luận.

2. Ngẫu nhiên hóa

Sự chỉ định những liều khác nhau của chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng cho các đơn vị thí nghiệm (ví dụ động vật thí nghiệm, ống nghiệm, …) phải được thực hiện một cách hoàn toàn ngẫu nhiên. Những điều kiện thí nghiệm khác, nếu không bắt buộc phải chuẩn hóa nhằm giảm chênh lệch đáp ứng sinh học giữa các đơn vị thí nghiệm (ví dụ chọn lựa cân nặng, tuổi của động vật thí nghiệm, điều kiện môi trường thí nghiệm, …), cũng phải lựa chọn càng ngẫu nhiên càng tốt. Chọn vị trí của chuồng nuôi động vật thí nghiệm trong pḥng thí nghiệm, tŕnh tự phân liều, … là những ví dụ cho các quá tŕnh phải thực hiện một cách ngẫu nhiên.  

Ngẫu nhiên hóa có thể thực hiện bằng cách ném xúc xắc, xào các lá bài có đánh số, dùng bảng số ngẫu nhiên hay các phần mềm vi tính thích hợp.

3. Các định lượng dựa trên đáp ứng định lượng

3.1. Mô h́nh thống kê

3.1.1. Nguyên tắc chung

Hai mô h́nh thống kê thường dùng trong các định lượng sinh học là mô h́nh đường thẳng song song và mô h́nh tỷ lệ độ dốc. Trong chuyên luận này chỉ giới thiệu mô h́nh đường thẳng song song, để t́m hiểu thêm về mô h́nh c̣n lại, xin tham khảo Dược điển Châu Âu IV hay các tài liệu thống kê khác.

Chỉ có thể áp dụng mô h́nh thống kê đường thẳng song song nếu định lượng hội đủ các điều kiện sau:

1)   Các liều khác nhau của chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng đă được chỉ định cho từng đơn vị thí nghiệm một cách ngẫu nhiên;

2)   Các đáp ứng đo được của mỗi liều tuân theo phân phối chuẩn;

3)   Độ lệch chuẩn của các đáp ứng trong mỗi nhóm xử lư của cả chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng không khác nhau có ư nghĩa.

Sau khi tiến hành định lượng lặp lại nhiều lần, nhà phân tích phải kiểm tra các số liệu thu thập được bằng các phép kiểm tra thống kê thích hợp để đảm bảo định lượng thỏa măn các điều kiện nói trên:

-     Điều kiện 1 có thể thỏa măn nếu thực hiện đúng theo các hướng dẫn tŕnh bày ở mục 2 (Ngẫu nhiên hóa).

-     Điều kiện 2 thường được chấp nhận là luôn luôn thỏa măn trong thực tế. Trong những định lượng mà mỗi xử lư bao gồm một số đáp ứng lặp lại, một sự lệch nhỏ khỏi tính chuẩn sẽ không gây ảnh hưởng lớn đến kết quả.

-     Kiểm tra điều kiện 3 thông qua việc kiểm tra tính đồng nhất của các phương sai, ví dụ bằng phép kiểm tra Bartlett hoặc phép kiểm tra Hartley (xem các ví dụ trong mục 3.2.8).

Nếu điều kiện 2 và/hoặc điều kiện 3 không thỏa măn, thay đáp ứng y bằng ln(y),  hay y2 ‎‎có thể cho kết quả tốt.

Phép biến đổi y thành ln(y) rất hữu ích trong trường hợp tính đồng nhất của các phương sai không thỏa măn. Phép biến đổi này cũng giúp cải thiện tính chuẩn nếu phân phối bị lệch về bên phải.

Biến đổi y thành  thường được dùng khi các quan sát tuân theo phân phối Poisson, ví dụ khi các quan sát thu được bằng phương pháp đếm.

3.1.2. Các định lượng thường nhật

Trong các định lượng thường nhật, rất khó kiểm tra một cách hệ thống các điều kiện lư thuyết mô tả ở mục 3.1.1, bởi v́ trong thực tế số quan sát của các định lượng thường nhỏ do đó ảnh hưởng đến độ nhạy của các phép kiểm tra thống kê. Tuy nhiên, trong những định lượng cân xứng (là những định lượng có số liều của chế phẩm chuẩn bằng với số liều của chế phẩm cần định lượng, ví dụ: định lượng 2 + 2, 3 + 3, …) một sự lệch nhỏ khỏi tính chuẩn hay khỏi tính đồng nhất của phương sai không ảnh hưởng lớn đến kết quả định lượng. Do đó, chỉ cần kiểm tra lại các điều kiện lư thuyết nói trên khi một loạt các định lượng liên tục không thỏa măn phép kiểm tra tính có giá trị (xem mục 3.2.4).

Ngoài 3 điều kiện lư thuyết đă nói trên, mô h́nh thống kê đường thẳng song song c̣n yêu cầu mỗi định lượng phải thỏa măn 2 điều kiện sau:

4)   Đường biểu diễn mối quan hệ giữa logarithm liều và đáp ứng phải tuyến tính trong khoảng liều đă dùng trong định lượng.

5)   Đường thẳng ln(liều) – đáp ứng của chế phẩm cần định lượng phải song song với đường ln(liều) – đáp ứng của chế phẩm chuẩn.

Chỉ có thể kiểm tra điều kiện 4 nếu định lượng được tiến hành với ít nhất 3 nồng độ pha loăng của mỗi chế phẩm (định lượng 3 liều hay lớn hơn). Tuy nhiên, nếu tính tuyến tính của đường logarithm liều – đáp ứng, trong một khoảng liều nhất định, đă được chứng minh bởi một số lượng đủ lớn các định lượng có 3 liều trở lên, có thể tiến hành định lượng chỉ với 2 liều của mỗi chế phẩm (định lượng 2 liều) trong các định lượng hàng ngày, dùng khoảng liều đă cho.

Trước khi tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy, cần phải tiến hành phân tích phương sai để kiểm tra xem định lượng có đáp ứng các điều kiện 4 và 5 hay không.

Các định lượng dựa trên mô h́nh thống kê đường thẳng song song được tŕnh bày trong mục 3.2.

Nếu có bất cứ điều kiện nào trong 5 điều kiện nói trên không thỏa măn, các phương pháp tính toán giới thiệu ở đây sẽ không có giá trị. Khi đó, phải tiến hành rà soát lại các kỹ thuật định lượng để t́m ra nguyên nhân.

Nếu các phép kiểm tra thống kê cho thấy một hay một vài điều kiện trong 5 điều kiện nói trên không thỏa măn trong một số định lượng hàng ngày, không được chuyển ngay sang một phép biến đổi khác trừ khi có đủ bằng chứng rằng nguyên nhân gây ra hiện tượng đó không phải do ngẫu nhiên mà là kết quả của một sự thay đổi có hệ thống của các điều kiện thí nghiệm. Trước khi áp dụng một phép biến đổi mới vào các định lượng thường nhật phải lặp lại các phép kiểm tra thống kê đă tŕnh bày ở mục 3.1.1.

Để thu được một kết quả định lượng đáng tin cậy, có thể phải tiến hành một vài định lượng độc lập, sau đó phối hợp các kết quả định lượng lại với nhau (xem mục 4).  

Nhằm mục đích kiểm soát chất lượng của các định lượng hàng ngày, nên ghi chép lại các kết quả tính độ dốc hồi qui và sai số dư dưới dạng biểu đồ kiểm tra.

Nếu sai số dư lớn một cách bất thường, nguyên nhân đầu tiên phải nghĩ đến là sai sót trong kỹ thuật định lượng. Nếu các khảo sát khẳng định điều đó là đúng, phải lặp lại định lượng. Sai số dư cũng có thể rất lớn nếu trong dăy số liệu đo có một giá trị bất thường. Chỉ được loại bỏ giá trị nghi ngờ là bất thường nếu phép kiểm tra thống kê thích hợp cho thấy giá trị đó khác có ư nghĩa với các giá trị c̣n lại.

Sai số dư có thể nhỏ bất thường trong một số định lượng hàng ngày và làm cho các tỷ số F vượt quá giá trị tới hạn. Trong những trường hợp như vậy, có thể thay sai số dư tính được của định lượng bằng sai số dư trung b́nh của các định lượng trước đó trong biểu đồ kiểm tra.   

3.1.3. Cách tính toán và một số hạn chế

Dưới đây là 3 hạn chế áp đặt cho mỗi định lượng nhằm làm đơn giản hóa các công thức tính toán và làm tăng độ chính xác của định lượng:

a) số nồng độ pha loăng của mỗi chế phẩm trong một định lượng phải bằng nhau;

b) tỷ lệ giữa các liều kế tiếp nhau phải là một hằng số đối với tất cả các xử lư trong một định lượng, ví dụ: S2/S1 = S3/S2 = … = Z3/Z2;

c) số các đơn vị thí nghiệm của mỗi xử lư phải bằng nhau.

Các công thức tính toán áp dụng cho những định lượng có bố trí thí nghiệm tuân thủ đúng 3 hạn chế nêu trên được giới thiệu ở mục 3.2. Đối với các định lượng có bố trí thí nghiệm không tuân theo các hạn chế đă nêu các công thức tính toán sẽ rất phức tạp và không được giới thiệu trong chuyên luận này.  

Trong mục 3.2.8 có tŕnh bày một số ví dụ để minh họa cho phần lư thuyết thống kê. Có thể dùng các số liệu trong các ví dụ đó để kiểm tra các phần mềm dùng trong phân tích thống kê kết quả định lượng sinh học. 

3.2. Mô h́nh đường thẳng song song

3.2.1. Giới thiệu

Mô h́nh đường thẳng song song dựa trên quan hệ tuyến tính giữa đáp ứng Y  và logarithm X của liều D.

Y = a + bX

Trong đó:

Y = đáp ứng mong đợi.

X = ln(liều) = ln(D).

ab là các hằng số.

Mô h́nh đường thẳng song song có thể được minh họa bởi đồ thị trong h́nh 3.2.1.-I. Trên đồ thị, trục hoành biểu diễn các logarithm liều, trục tung biễu diễn các đáp ứng đo được. Các đáp ứng riêng của mỗi xử lư được biểu thị bằng các chấm đen. Hai đường trên đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa logarithm liều và đáp ứng đo được của chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng.

Từ trục tung kẻ một đường thẳng bất kỳ song song với trục hoành, cắt hai đường ln(liều) – đáp ứng tại hai điểm. Giá trị tương ứng của hai diểm này trên trục hoành là ZSZU , đây là hai nồng độ của chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng cho cùng đáp ứng sinh học. V́ khi pha các dung dịch thử của chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng ta đă giả định ZS = ZU, do đó, đoạn thẳng ln(ZS) – ln(ZU) là chênh lệch giữa nồng độ thật và nồng độ giả định của chế phẩm cần định lượng trên thang logarithm. Đó cũng chính là logarithm tỷ lệ hoạt lực giữa chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng.

ZS đă biết, ta có thể tính được ZU.

 

Mẫu thử

 

 

 

 

 

 

 

 

 


H́nh 3.2.1.-I. – Mô h́nh đường thẳng song song của một định lượng 3 + 3.

Chú ư: logarithm tự nhiên ln (hay loge) được sử dụng xuyên suốt trong chuyên luận này, do đó, antilogarithm tương đương với ex. Tuy nhiên, nếu muốn, hoàn toàn có thể dùng logarithm cơ số 10 ( hay log10 ) thay cho ln, khi đó, antilogarithm tương ứng với 10x.

Trong một định lượng, nếu đoạn thẳng ln(ZS) – ln(ZU) càng nhỏ, tức là nếu hoạt lực giả định của chế phẩm cần định lượng càng gần với hoạt lực thật của nó, kết quả định lượng sẽ càng chính xác.

3.2.2. Bố trí thí nghiệm

Các định lượng sinh học có thể được bố trí theo một số cách khác nhau như tŕnh bày dưới đây.

3.2.2.1. Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên hoàn toàn

Nếu toàn bộ các đơn vị thí nghiệm (động vật, ống nghiệm,…) tương đối đồng nhất, việc chỉ định các đơn vị thí nghiệm cho các xử lư khác nhau phải được tiến hành một cách ngẫu nhiên, ví dụ dùng bảng hoán vị ngẫu nhiên.

Nếu chia các đơn vị thí nghiệm thành các phân nhóm, ví dụ theo vị trí vật lư hay ngày thí nghiệm, mà các đáp ứng đo được có độ phân tán nhỏ hơn, ta có thể tăng độ chính xác của định lượng bằng cách áp dụng một số hạn chế trong cách bố trí thí nghiệm. Sự sắp xếp các đơn vị thí nghiệm theo các hạn chế đó cho phép loại bỏ một số nguồn gây sai số không liên quan.

3.2.2.2. Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối

Trong kiểu bố trí thí nghiệm này, có thể giảm sai số của định lượng bằng cách tách độ phân tán giữa các khối, ví dụ độ phân tán giữa các hộp Petri trong định lượng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán, khỏi sai số toàn phần. Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối đ̣i hỏi mỗi khối phải có số xử lư bằng nhau và chỉ thích hợp nếu khối (ví dụ hộp Petri) đủ lớn để có thể chứa tất cả các xử lư của định lượng.

Bảng 3.2.3.-V   tŕnh bày công thức tính toán áp dụng cho các định lượng có bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối, trong đó mỗi xử lư chỉ xuất hiện một lần duy nhất trong mỗi khối (Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối không lặp). Ví dụ minh họa cho kiểu bố trí thí nghiệm này được tŕnh bày trong ví dụ 3.2.8.2.

3.2.2.3. Bố trí thí nghiệm h́nh vuông Latin

Kiểu bố trí thí nghiệm này thích hợp với những định lượng mà đáp ứng chịu ảnh hưởng của 2 nguồn gây sai số khác nhau, trong đó mỗi nguồn sai số có k mức hay k vị trí khác nhau. Ví dụ, trong định lượng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán các xử lư có thể được sắp thành dăy trên một khay lớn, mỗi xử lư chỉ xuất hiện một lần duy nhất trong mỗi hàng và mỗi cột. Chỉ có thể áp dụng kiểu bố trí thí nghiệm h́nh vuông Latin khi số hàng bằng với số cột và số xử lư của mỗi chế phẩm phải bằng nhau.

Các đáp ứng đo được được ghi vào một bảng h́nh vuông gọi là h́nh vuông Latin. Sai số do chênh lệch đáp ứng giữa k hàng và giữa k cột sẽ được tách khỏi sai số toàn phần, do đó làm giảm sai số của định lượng.

Bảng 3.2.3.-V   tŕnh bày công thức tính toán áp dụng cho các định lượng có bố trí thí nghiệm h́nh vuông Latin, trong đó mỗi xử lư chỉ xuất hiện một lần duy nhất trong mỗi hàng và mỗi cột. Ví dụ minh họa cho kiểu bố trí thí nghiệm này được tŕnh bày trong ví dụ 3.2.8.3.

3.2.2.4. Bố trí thí nghiệm chéo

Kiểu bố trí thí nghiệm này được áp dụng trong trường hợp các đơn vị thí nghiệm có thể chia thành các khối khác nhau, nhưng mỗi khối chỉ có thể nhận hai xử lư, ví dụ một khối chỉ gồm một đơn vị thí nghiệm được thử hai lần vào hai thời điểm khác nhau. Mục đích của kiểu bố trí chéo là làm tăng độ chính xác của định lượng bằng cách loại trừ ảnh hưởng do sự khác biệt giữa các đơn vị thí nghiệm. Nếu định lượng tiến hành với 2 liều của chế phẩm chuẩn và chế phẩm cần định lượng, ta có kiểu thí nghiệm chéo đôi.

Bảng 3.2.2.-I. – Cách sắp xếp các liều trong  bố trí thí nghiệm chéo 

Nhóm các đơn vị thí nghiệm

Giai đoạn I

Giai đoạn II

1

s1

u2

2

s2

u1

3

u1

s2

4

u2

s1

Trong thí nghiệm chéo đôi, định lượng được chia thành hai giai đoạn, mỗi giai đoạn tiến hành vào những thời điểm khác nhau. Các đơn vị thí nghiệm được chia thành bốn nhóm, mỗi nhóm nhận một trong bốn xử lư ở giai đoạn đầu của thí nghiệm. Đơn vị nhận một chế phẩm trong giai đoạn đầu sẽ nhận chế phẩm khác trong giai đoạn sau, các đơn vị nhận liều thấp trong giai đoạn đầu sẽ nhận liều cao trong giai đoạn sau. Cách sắp xếp các liều cho ở Bảng 3.2.2.-I. Ví dụ minh họa cho kiểu bố trí thí nghiệm này được tŕnh bày trong ví dụ 3.2.8.4.

3.2.3. Phân tích phương sai

Mục này tŕnh bày các công thức cần thiết để phân tích phương sai. Người đọc sẽ dễ hiểu hơn nếu tham khảo thêm các ví dụ ở mục 3.2.8 và các kư hiệu thuật ngữ ở mục 6.

Các công thức tŕnh bày ở đây có thể áp dụng cho các định lượng đối xứng trong đó một hay nhiều chế phẩm cần thử (U, …, Z) được so sánh với cùng một chế phẩm chuẩn S, với điều kiện định lượng phải đáp ứng được các điều kiện sau: 1) tỷ lệ giữa các liều kế tiếp nhau của tất cả các chế phẩm phải là một hằng số, 2) số xử lư của mỗi chế phẩm và 3) số đơn vị thí nghiệm trong mỗi xử lư phải bằng nhau (xem mục 3.1.3).

Ngoại trừ một vài khác biệt nhỏ trong cách tính sai số dư, phương pháp phân tích các số liệu của mỗi định lượng sinh học về cơ bản là giống nhau đối với các kiểu bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên hoàn toàn, ngẫu nhiên theo khối và h́nh vuông Latin. Bố trí thí nghiệm chéo có công thức tính hoàn toàn khác và do đó được tŕnh bày trực tiếp trong ví dụ 3.2.8.4.

Để chuẩn bị số liệu cho phân tích phương sai, đầu tiên phải tính tổng đáp ứng của mỗi liều, tổng đáp ứng và tương phản tuyến tính (linear contrast) của mỗi chế phẩm, đối với các định lượng có nhiều hơn hai liều của mỗi chế phẩm, cần tính thêm tương phản bậc hai (quadratic contrast). Các Bảng 3.2.3.-I, 3.2.3.-II và 3.2.3.-III tŕnh bày các công thức tính đó.

Bảng 3.2.3.-I. – Công thức tính toán cho các định lượng mỗi chế phẩm có hai liều

 

Chế phẩm chuẩn

S

Chế phẩm thử thứ nhất U

Chế phẩm thử thứ (h – 1)

Z

Tổng đáp ứng của liều thấp

S1

U1

Z1

Tổng đáp ứng của liều cao

S2

U2

Z2

Tổng đáp ứng của chế phẩm

S1 + S2 = S

U1 + U2 = U

Z1 + Z2 = Z

Tương phản tuyến tính

S2 – S1 = LS

U2 – U1 = LU

Z2 – Z1 = LZ

Bảng 3.2.3.-II. – Công thức tính toán cho các định lượng mỗi chế phẩm có ba liều

 

Chế phẩm chuẩn

S

Chế phẩm thử thứ nhất U

Chế phẩm thử thứ (h – 1)

Z

Tổng đáp ứng của liều thấp

S1

U1

Z1

Tổng đáp ứng của liều trung b́nh

S2

U2

Z2

Tổng đáp ứng của liều cao

S3

U3

Z3

Tổng đáp ứng của chế phẩm

S1 + S2 + S3 = S

U1 + U2 + U3 = U

Z1 + Z2 + Z3 = Z

Tương phản tuyến tính

S3 – S1 = LS

U3 – U1 = LU

Z3 – Z1 = LZ

Tương phản bậc hai

S1 – 2S2 + S3 = QS

U1 – 2U2 + U3 = QU

Z1 – 2Z2 + Z3 = QZ

Bảng 3.2.3.-III. – Công thức tính toán cho các định lượng mỗi chế phẩm có bốn liều

 

Chế phẩm chuẩn

S

Chế phẩm thử thứ nhất

U

Chế phẩm thử thứ (h – 1) Z

Tổng đáp ứng của liều thấp nhất

S1

U1

Z1

Tổng đáp ứng của liều thứ hai

S2

U2

Z2

Tổng đáp ứng của liều thứ ba

S3

U3

Z3

Tổng đáp ứng của liều cao nhất

S4

U4

Z4

Tổng đáp ứng của chế phẩm

S1 + S2 + S3 + S4 = S

U1 + U2 + U3 + U4 = U

Z1 + Z2 + Z3 + Z4 = Z

Tương phản tuyến tính

3S4 + S3 – S2 – 3S1 = LS

3U4 + U3 – U2 – 3U1 = LU

3Z4 + Z3 – Z2 – 3Z1 = LZ

Tương phản bậc hai

S1 - S2 - S3 + S4 = QS

U1 – U2 – U3 + U4 = QU

Z1 – Z2 – Z3 + Z4 = QZ

Tương phản bậc ba

3S2 – S1 + S4 – 3S3 = JS

3U2 – U1 + U4 – 3U3 = JU

3Z2 – Z1 + Z4 – 3Z3 = JZ

Trong bước kế tiếp, sai số toàn phần của định lượng, c̣n gọi là sai số chung, được phân tích thành các sai số riêng phần như tŕnh bày ở Bảng 3.2.3.-IV, các tổng các b́nh phương được tính từ các giá trị thu được ở các Bảng 3.2.3.-I, 3.2.3.-II và 3.2.3.-III.

Bảng 3.2.3.-IV Kiểm tra tính có giá trị của định lượng

Nguồn gây sai số

Bậc tự do (f)

Tổng các b́nh phương

2 liều/chế phẩm

3 liều/chế phẩm

4 liều/chế phẩm

Chế phẩm

h - 1

Hồi qui tuyến tính

1

Tính không song song

h - 1

Tính không tuyến tính (Độ cong)

h  (3 liều)

2h (4 liều)

-


Tính sai số dư (residual error) bằng cách lấy sai số toàn phần của định lượng trừ đi các sai số riêng của các nguồn gây sai số khác nhau (Bảng 3.2.3.-V), nguồn gây sai số có thể nhận dạng được khác nhau tùy theo kiểu bố trí thí nghiệm. Trong Bảng 3.2.3.-V, ∑y2 là tổng của b́nh phương của tất cả các đáp ứng đo được của mỗi định lượng, K là số hiệu chỉnh:

 

Kết thúc phân tích phương sai bằng cách chia các tổng các b́nh phương tính được từ Bảng 3.2.3.-IV cho bậc tự do tương ứng để được các b́nh phương trung b́nh.

B́nh phương trung b́nh của sai số dư cũng được tính theo cách tương tự, dùng số liệu tương ứng ở Bảng 3.2.3.-V.

B́nh phương trung b́nh của mỗi biến số cần kiểm tra sẽ được biểu diễn dưới dạng một tỷ số với sai số dư s2, gọi là tỷ số F. Đánh giá mức ư nghĩa của các tỷ số F bằng cách so sánh F tính được (viết tắt là Fcal.) với giá trị F tới hạn (viết tắt là Fcrit.) tra từ Bảng 3.2.4.-I hay bằng cách dùng các phần mềm vi tính thích hợp. Nếu dùng bảng tra cứu, đọc Fcrit. từ Bảng 3.2.4.-I tại giao điểm giữa cột tương ứng với bậc tự do của b́nh phương trung b́nh của biến số cần kiểm tra (f1) và hàng tương ứng với bậc tự do của s2 (f2). Biến số cần kiểm tra được coi là có ư nghĩa nếu Fcal. > Fcrit. ở xác suất P = 0,05 hay rất có ư nghĩa nếu Fcal. > Fcrit. ở xác suất P = 0,01.  

Bảng 3.2.3.-V. – Tính sai số dư

Nguồn gây sai số

Bậc tự do (f)

Tổng các b́nh phương

Ngẫu nhiên hoàn toàn

Ngẫu nhiên theo khối

H́nh vuông Latin

Giữa các xử lư

k – 1

Giữa các khối (hàng)

n – 1

-

Giữa các khối (cột)

n – 1

-

-

Sai số dư

Hiệu số

*

*

*

Sai số toàn phần

N – 1

 

* Lấy sai số toàn phần trừ đi các tổng các b́nh phương tương ứng của mỗi phương pháp bố trí thí nghiệm.

3.2.4. Kiểm tra tính có giá trị của định lượng

Một định lượng được coi là có giá trị thống kê (statistically valid) nếu:

1)   Đại lượng hồi qui tuyến tính rất có ư nghĩa, Fcal. > Fcrit. ở xác suất P = 0,01 (P < 0,01), chứng tỏ độ dốc của đường ln(liều) – đáp ứng rất khác 0.

2)   Đại lượng không tuyến tính (non-linearity) phải không có ư nghĩa, Fcal. < Fcrit. ở xác suất 0,05 (P > 0,05), chứng tỏ thoả măn điều kiện 4, tức là các đường ln(liều) – đáp ứng của chế phẩm chuẩn S và các chế phẩm thử (U,…,Z) thẳng.

3)   Đại lượng không song song (non-parallelism) phải không có ư nghĩa, Fcal. < Fcrit. ở xác suất 0,05 (P > 0,05), chứng tỏ định lượng đáp ứng điều kiện 5, hay nói cách khác các đường ln(liều) – đáp ứng của các chế phẩm thử (U,…,Z) song song với đường ln(liều) – đáp ứng của chế phẩm chuẩn S.

Nếu đại lượng không song song có ư nghĩa trong một định lượng có h chế phẩm, kể cả chế phẩm chuẩn, một trong số các chế phẩm cần thử có thể có độ dốc của đường ln(liều) – đáp ứng khác với các chế phẩm c̣n lại. Tính t’ (phép kiểm tra Dunnett) của mỗi chế phẩm cần định lượng (U, …, Z) theo công thức:

                                                                                                                       (3.2.4.-I)

Đối với các định lượng có bốn liều của mỗi chế phẩm, tính t’ theo công thức:

                                             

So sánh mỗi t’ tính được với giá trị tới hạn đọc từ Bảng 3.2.4.-II, với f1 = h – 1,  f2 là bậc tự do của s2. Nếu t’ có ư nghĩa với một chế phẩm bất kỳ, loại bỏ tất cả các số liệu liên quan đến chế phẩm đó và lặp lại từ đầu phép kiểm tra tính có giá trị với các chế phẩm c̣n lại.

Sai số do chế phẩm không được dùng để kiểm tra tính có giá trị của định lượng, tuy nhiên, trong những định lượng mà sai số dư lớn một cách bất thường và tỷ số F của nguồn gây sai số do chế phẩm rất có ư nghĩa, hoạt lực giả định của chế phẩm cần định lượng rất khác với hoạt lực thật của nó, cần phải lặp lại định lượng dùng hoạt lực tính được làm hoạt lực giả định.

Bảng 3.2.4.-I. – Mức ư nghĩa của tỷ số F

 

 

f1

 

 

1

2

3

4

5

6

7

8

20

f2

12

4,75

3,89

3,49

3,26

3,11

3,00

2,91

2,85

2,54

2,30

 

9,33

6,93

5,95

5,41

5,06

4,82

4,64

4,50

3,86

3,36

15

4,54

3,68

3,29

3,06

2,90

2,79

2,71

2,64

2,33

2,07

 

8,68

6,36

5,42

4,89

4,56

4,32

4,14

4,00

3,37

2,87

20

4,35

3,49

3,10

2,87

2,71

2,60

2,51

2,45

2,12

1,84

 

8,10

5,85

4,94

4,43

4,10

3,87

3,70

3,56

2,94

2,42

25

4,24

3,39

2,99

2,76

2,60

2,49

2,40

2,34

2,01

1,71

 

7,77

5,57

4,68

4,18

3,85

3,63

3,46

3,32

2,70

2,17

30

4,17

3,32

2,92

2,69

2,53

2,42

2,33

2,27

1,93

1,62

 

7,56

5,39

4,51

4,02

3,70

3,47

3,30

3,17

2,55

2,01

40

4,08

3,23

2,84

2,61

2,45

2,34

2,25

2,18

1,84

1,51

 

7,31

5,18

4,31

3,83

3,51

3,29

3,12

2,99

2,37

1,80

60

4,00

3,15

2,76

2,53

2,37

2,25

2,17

2,10

1,75

1,39

 

7,08

4,98

4,13

3,65

3,34

3,12

2,95

2,82

2,20

1,60

3,84

3,00

2,60

2,37

2,21

2,10

2,01

1,94

1,57

1,00

 

6,63

4,61

3,78

3,32

3,02

2,80

2,64

2,51

1,88

1,00

* Nếu F tính được  > F tới hạn, biến số cần kiểm tra được coi là có ư nghĩa (ḍng trên, p = 0,05), hay rất có ư nghĩa (ḍng dưới, p = 0,01).  f1 là bậc tự do của tử số,  f2 là bậc tự do của mẫu số.

Bảng 3.2.4.-II. – Mức ư nghĩa của t’

f1 = (h – 1) = số chế phẩm cần định lượng

   f2

1

2

3

4

5

6

7

8

9

   5

2,57

3,03

3,29

3,48

3,62

3,73

3,82

3,90

3,97

   6

2,45

2,86

3,10

3,26

3,39

3,49

3,57

3,64

3,71

   7

2,36

2,75

2,97

3,12

3,24

3,33

3,41

3,47

3,53

   8

2,31

2,67

2,88

3,02

3,13

3,22

3,29

3,35

3,41

   9

2,26

2,61

2,81

2,95

3,05

3,14

3,20

3,26

3,32

10

2,23

2,57

2,76

2,89

2,99

3,07

3,14

3,19

3,24

11

2,20

2,53

2,72

2,84

2,94

3,02

3,08

3,14

3,19

12

2,18

2,50

2,68

2,81

2,90

2,98

3,04

3,09

3,14

13

2,16

2,48

2,65

2,78

2,87

2,94

3,00

3,06

3,10

14

2,14

2,46

2,63

2,75

2,84

2,91

2,97

3,02

3,07

15

2,13

2,44

2,61

2,73

2,82

2,89

2,95

3,00

3,04

16

2,12

2,42

2,59

2,71

2,80

2,87

2,92

2,97

3,02

17

2,11

2,41

2,58

2,69

2,78

2,85

2,90

2,95

3,00

18

2,10

2,40

2,56

2,68

2,76

2,83

2,89

2,94

2,98

19

2,09

2,39

2,55

2,66

2,75

2,81

2,87

2,92

2,96

20

2,09

2,38

2,54

2,65

2,73

2,80

2,86

2,90

2,95

24

2,06

2,35

2,51

2,61

2,70

2,76

2,81

2,86

2,90

30

2,04

2,32

2,47

2,58

2,66

2,72

2,77

2,82

2,86

40

2,02

2,29

2,44

2,54

2,62

2,68

2,73

2,77

2,81

60

2,00

2,27

2,41

2,51

2,58

2,64

2,69

2,73

2,77

120

1,98

2,24

2,38

2,47

2,55

2,60

2,65

2,69

2,73

  ∞

1,96

2,21

2,35

2,44

2,51

2,57

2,61

2,65

2,69

Nếu định lượng thỏa măn các phép kiểm tra tính có giá trị, hay nói cách khác, định lượng có giá trị thống kê, có thể tiếp tục tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy bằng các phương pháp mô tả trong mục kế tiếp.

3.2.5. Tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy

Để tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy, trước hết phải tính đáp ứng trung b́nh của mỗi chế phẩm :

                                                                                                                   (3.2.5.-1)

Tiến hành tương tự như vậy với các chế phẩm khác.

Gọi I là khoảng cách giữa ln các liều kế tiếp nhau của một chế phẩm bất kỳ (I là hằng số trong một định lượng), ví dụ I = ln(S2) – ln(S1), độ dốc chung (b) của một định lượng bao gồm h chế phẩm, mỗi chế phẩm có d liều khác nhau được tính theo công thức:

                                                                                                 (3.2.5.-2)

Đối với các định lượng mỗi chế phẩm có bốn liều, tính b theo công thức:

                                           

ln(tỷ lệ hoạt lực) của chế phẩm cần định lượng U được tính theo công thức:

                                                                                                          (3.2.5.-3)

Gọi AU là hoạt lực giả định của chế phẩm U, logarithm hoạt lực của U (MU) sẽ bằng:

                                                                                                      (3.2.5.-4)

Hoạt lực tính được là ước lượng của hoạt lực thật của chế phẩm cần định lượng. Các giới hạn tin cậy của hoạt lực tính được là khoảng có khả năng chứa hoạt lực thật của chế phẩm cần định lượng với xác suất 95 %. Logarithm của các giới hạn tin cậy được tính theo công thức sau:

                     (3.2.5.-5) 

với:                                                                                                           (3.2.5.-6)

E là giá trị tính được từ Bảng 3.2.3.-IV, tính s2 bằng cách chia tổng các b́nh phương của biến số sai số dư trong Bảng 3.2.5.-V cho bậc tự do tương ứng của nó, t là giá trị đọc được từ Bảng 5.1 với xác suất P = 0,95 và f là bậc tự do của s2.

Trong những định lượng đối xứng, công thức tính các giới hạn tin cậy có thể đơn giản hóa thành:

                                  (3.2.5.-7)

với:                             

C là tiêu chuẩn đánh giá ư nghĩa của đường hồi qui, trong một định lượng có độ dốc đạt yêu cầu giá trị của C rất gần với 1. Nếu C < 0 hồi qui tuyến tính không có ư nghĩa.

Tính hoạt lực của chế phẩm U (RU) và các giới hạn tin cậy của nó bằng cách lấy antilogarithm các giá trị tính được từ các công thức 3.2.5.-4 và 3.2.5.-7.

                                                                    (3.2.5.-8)

           (3.2.5.-9)

         (3.2.5.-10)

FLU là giới hạn tin cậy trên và FLL là giới hạn tin cậy dưới của hoạt lực tính được RU.           

Nếu nồng độ dung dịch gốc của chế phẩm chuẩn và các chế phẩm thử không hoàn toàn giống nhau, phải hiệu chỉnh hoạt lực tính được và các giới hạn tin cậy với một hệ số, gọi là hệ số hiệu chỉnh (xem ví dụ 3.2.8.3). Hệ số hiệu chỉnh là tỷ số giữa nồng độ dung dịch gốc của chất chuẩn và nồng độ dung dịch gốc của mỗi chế cần định lượng. 

3.2.6. Các giá trị bị mất

Trong những định lượng đối xứng, một sự cố ngẫu nhiên có thể dẫn đến việc mất một hay nhiều giá trị đo, ví dụ động vật thí nghiệm chết, ṿng vô khuẩn bị méo không đo được, … Nếu sự cố xảy ra không liên quan đến thành phần của chế phẩm cần thử, vẫn có thể tính được kết quả định lượng một cách chính xác, tuy nhiên khi đó các công thức tính toán sẽ trở nên rất phức tạp. Để có thể tiếp tục dùng các công thức tính toán đơn giản của bố trí thí nghiệm đối xứng, có thể phục hồi tính đối xứng của định lượng bằng  một trong hai cách sau:

1) Nếu số đáp ứng của mỗi xử lư đủ lớn, giảm số đáp ứng trong các xử lư có số đáp ứng lớn hơn cho đến khi số đáp ứng của tất cả các xử lư bằng nhau. Nếu động vật thí nghiệm đă được chỉ định một cách ngẫu nhiên cho mỗi xử lư, bỏ một hay vài đáp ứng, được chọn ngẫu nhiên, từ các xử lư có số đáp ứng lớn sẽ làm cho định lượng trở thành đối xứng. Đối với các định lượng bố trí thí nghiệm theo kiểu ngẫu nhiên theo khối, cách đơn giản nhất là bỏ tất cả các đáp ứng của khối có giá trị bị mất. Ví dụ, chỉ giữ lại kết quả đo của các hộp Petri có đủ 6 ṿng vô khuẩn trong định lượng kháng sinh 3 + 3 bằng phương pháp khuếch tán, dùng hộp Petri.

2) Thay các giá trị bị mất bằng các giá trị tính được từ những giá trị c̣n lại. Công thức tính các giá trị mất được tŕnh bày ở bên dưới, bậc tự do của sai số toàn phần và sai số dư sẽ phải giảm đi một đơn vị cho mỗi giá trị bị mất. Cần nhớ rằng đây chỉ là phương pháp gần đúng, phương pháp chính xác luôn luôn cho kết quả đáng tin cậy hơn.

Nếu có nhiều quan sát bị mất, thay tất cả các giá trị bị mất, trừ một quan sát, bằng các giá trị ước lượng thô và dùng công thức thích hợp để tính giá trị của quan sát đó dựa trên các giá trị c̣n lại, kể cả các giá trị ước lượng thô. Thay quan sát bị mất bằng giá trị vừa tính được. Tiếp tục tính theo cách trên với giá trị ước lượng thô thứ nhất … Sau khi đă thay thế tất cả các quan sát bị mất, lặp lại từ đầu chu tŕnh tính toán cho đến khi hai chu tŕnh kế tiếp nhau cho cùng kết quả.

Kết quả phân tích chỉ được chấp nhận nếu số các giá trị thay thế tương đối nhỏ (nhỏ hơn 5 %) so với tổng số đáp ứng của toàn bộ định lượng. Cần đặc biệt thận trọng trong trường hợp các giá trị bị mất có khuynh hướng tập trung trong một xử lư hay một khối nhất định.

Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên hoàn toàn

Trong kiểu bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên hoàn toàn, thay giá trị bị mất bằng trung b́nh số học của các đáp ứng khác trong cùng xử lư.

 Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối

Giá trị bị mất (y’) được tính bằng công thức:

                                                                                                        (3.2.6.-1)

Trong đó B’ là tổng đáp ứng của khối chứa giá trị bị mất, T’ là tổng đáp ứng của xử lư chứa giá trị bị mất, G’ là tổng tất cả các đáp ứng c̣n lại trong định lượng.

Để minh họa, giả sử giá trị của u1 trong khối thứ nhất (trong trường hợp này là hàng hay hộp Petri) ở ví dụ 3.2.8.2, Bảng 3.2.8.2.-II bị mất (u1 = 174). Với:

B’ = 1.050

T’ = 869

G’ = 7.189

k = 6

n = 6

y’ = 173. Dùng giá trị tính được 173 thay cho đáp ứng của u1 trong hộp số 1 của Bảng 3.2.8.2.-II và tiếp tục tính toán như tŕnh bày trong ví dụ 3.2.8.2 nhưng với bậc tự do của sai số toàn phần là 34, và bậc tự do của sai số dư là 24.

Bố trí thí nghiệm h́nh vuông Latin

Giá trị bị mất (y’) được tính bằng công thức:

                                                                                               (3.2.6.-2)

Trong đó, B’C’ là tổng các đáp ứng trong hàng và cột chứa giá trị bị mất. Trong bố trí thí nghiệm h́nh vuông Latin k = n. Giả sử giá trị 161 của đáp ứng ở cột thứ 1 và hàng thứ 1 trong Bảng 3.2.8.3.-II, ví dụ 3.2.8.3 bị mất, nó sẽ được thay thế bởi giá trị 150 tính được  bằng công thức 3.2.6.-2 với:

B’ = 890

C’ = 876

T’ = 791

G’ = 6.175

k = 6

Các bậc tự do sẽ bị giảm xuống c̣n 19 đối với sai số dư và 34 đối với sai số toàn phần.

Bố trí thí nghiệm chéo

Nếu có giá trị bị mất trong kiểu bố trí thí nghiệm chéo phải tham khảo các tài liệu thống kê v́ công thức tính sẽ rất khác nhau tùy theo cách phối hợp các xử lư.

3.2.7. Các định lượng đối xứng một phần

Nếu hoạt lực giả định của chế phẩm cần định lượng, là hoạt lực được dùng để tính lượng chế phẩm thử cần lấy khi pha các dung dịch thử của chế phẩm thử, khác xa với hoạt lực thật, nồng độ cao nhất hoặc nồng độ thấp nhất của chế phẩm thử có thể nằm lọt ra ngoài vùng tuyến tính của đường ln(liều) – đáp ứng, do đó định lượng sẽ không có giá trị thống kê do không thỏa măn tính tuyến tính và/hoặc tính song song.

Có thể tính hoạt lực từ các số liệu c̣n lại, sau khi loại bỏ các đáp ứng của nồng độ cao nhất hoặc nồng độ thấp nhất của chế phẩm thử và dùng hoạt lực tính được để giả định lại hoạt lực của chế phẩm thử cho sát với hoạt lực thật hơn trong lần định lượng kế tiếp.

Logarithm tỷ lệ hoạt lực được tính bằng công thức:

                                                                                                     (3.2.7.-1)

Công thức trên rất giống với phương tŕnh 3.2.5.-3, tuy nhiên, ln(tỷ lệ hoạt lực) sẽ bị trừ đi một đại lượng bằng I/2 nếu bỏ nồng độ thấp nhất, và cộng thêm I/2 nếu bỏ nồng độ cao nhất.

Tính các đáp ứng trung b́nh theo cách tương tự như định lượng cân xứng hoàn toàn (phương tŕnh 3.2.5.-1), nhưng công thức tính độ dốc (b) có một số biến đổi tùy theo bố trí thí nghiệm.

Trong định lượng nhiều chế phẩm, mỗi chế phẩm có 2 liều, tính độ dốc bằng công thức:

                                                                                                          (3.2.7.-2)

Chú ư: trong công thức trên, tử số không bao gồm LU v́ chế phẩm U chỉ c̣n một nồng độ.

Đối với định lượng chỉ có một chế phẩm thử:

                                                                                                                      (3.2.7.-3)

Trong định lượng đa chế phẩm, mỗi chế phẩm có 3 liều, tính các tương phản tuyến tính (LS, …, LZ) theo công thức cho ở Bảng 3.2.3.-II, riêng LU tính bằng công thức ở Bảng 3.2.3.-I. Công thức tính độ dốc sẽ là:

                                                                                             (3.2.7.-4)

Đối với định lượng chỉ có một chế phẩm thử, công thức trên trở thành:

                                                                                                            (3.2.7.-5)

3.2.8. Các ví dụ

Mục này tŕnh bày một số ví dụ minh họa cách sử dụng các công thức tính toán liên quan đến mô h́nh đường thẳng song song.

Các ví dụ giới thiệu ở đây chỉ nhằm mục đích minh họa cho các phương pháp tính toán thống kê và không phải là phương pháp bắt buộc phải áp dụng nếu chuyên luận riêng cho phép dùng phương pháp khác.

Để có thể sử dụng các ví dụ trong chuyên luận này như nguồn số liệu chuẩn phục vụ cho việc kiểm tra các chương tŕnh vi tính, thương mại hay tự biên soạn, dùng trong phân tích thống kê kết quả định lượng sinh học, các kết quả tính toán có thể chứa nhiều số thập phân hơn mức cần thiết. Có thể dùng phương pháp tính toán khác với phương pháp giới thiệu trong chuyên luận này, nhưng kết quả cuối cùng phải giống như các kết quả trong các ví dụ tŕnh bày ở đây.  

Ví dụ 3.2.8.1. Định lượng đồng thời nhiều chế phẩm thử, mỗi chế phẩm có 2 liều với bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên hoàn toàn 

Định lượng corticotrophin bằng phương pháp tiêm dưới da chuột

Liều chỉ định của chế phẩm chuẩn là 0,25 và 1,0 đơn vị cho mỗi 100 g thể trọng chuột thí nghiệm. Hai chế phẩm thử đều có hoạt lực giả định là 1 đơn vị/mg và có liều chỉ định giống như chế phẩm chuẩn. Các đáp ứng riêng và đáp ứng trung b́nh của mỗi nhóm xử lư cho ở Bảng 3.2.8.1.-I.

 

Bảng 3.2.8.1.-I - Đáp ứng metameter y - khối lượng Acid ascorbic (mg) trên 100 g tuyến thượng thận

 

Chế phẩm chuẩn S

Chế phẩm thử U

Chế phẩm thử Z

Tổng số

 

s1

s2

u1

u2

z1

z2

 

300

289

310

230

250

236

 

 

310

221

290

210

268

213

 

 

330

267

360

280

273

283

 

 

290

236

341

261

240

269

 

 

364

250

321

241

307

251

 

 

328

231

370

290

270

294

 

 

390

229

303

223

317

223

 

 

360

269

334

254

312

250

 

 

342

233

295

216

320

216

 

 

306

259

315

235

265

265

 

Trung b́nh

332,0

248,4

323,9

244,0

282,2

250,0

 

Phương sai (vari)

1.026,7

483,8

725,0

718,7

854,6

784,7

ln (vari)

6,9341

6,1817

6,5862

6,5774

6,7507

6,6653

Bảng 3.2.8.1.-II – Các tổng đáp ứng và tương phản tuyến tính (xem công thức tính ở Bảng 3.2.3.-I)

 

Chế phẩm chuẩn S

Chế phẩm thử U

Chế phẩm thử Z

Tổng số

Liều thấp

S1 = 3.320

U1 = 3.239

Z1 = 2.822

 

Liều cao

S2 = 2.484

U2 = 2.440

Z2 = 2.500

 

Tổng đáp ứng của chế phẩm

S = 5.804

U = 5.679

Z = 5.322

Tương phản tuyến tính

LS = -836

LU = -799

LS = -322

                                   

                                   

Tính các tổng các b́nh phương theo công thức trong các Bảng 3.2.3.-IV và 3.2.3.-V dùng các số liệu tính được ở Bảng 3.3.8.1.-IV:

Chế phẩm

Hồi qui tuyến tính =

Không song song =  

Giữa các xử lư =

Toàn phần =

Sai số dư = Toàn phần – Giữa các xử lư = 119.646,58 – 78.305,68 = 41.340,90

Bảng 3.2.8.1.-III – Phân tích phương sai

Nguồn gây sai số

Bậc tự do

Tổng các b́nh phương

B́nh phương trung b́nh

Tỷ số F

Xác suất

Chế phẩm

2

6.256,6

3128,3

 

 

Hồi qui tuyến tính

1

63.830,8

63.830,8

83,4

< 0,01

Không song song

2

8.218,2

4109,1

5,4

< 0,05

Giữa các xử lư

5

78.305,7

 

 

 

Sai số dư

54

41.340,9

765,6

 

 

Sai số toàn phần

59

119.646,6

 

 

 

Kiểm tra tính có giá trị của định lượng

Kết quả phân tích phương sai cho thấy, tỷ số F của biến số hồi qui Fcal = 83,4 rất lớn so với F tới hạn ở xác suất P = 0,01, f1 = 1 và f2 = 54: F(P = 0,01;f1 = 1;f2 = 54) = 7,13[1], do đó biến số hồi qui rất có ư nghĩa.

Biến số không song song cũng có ư nghĩa, Fcal. = 5,4 > F(P = 0,05,f1 = 2,f2 = 54) = 3,17. Khảo sát Bảng 3.2.8.1.-IV cho thấy chế phẩm Z có tương phản tuyến tính LZ rất khác với LSLU. Do đó, có khả năng độ dốc của đường ln(liều) – đáp ứng của chế phẩm Z không phù hợp với các chế phẩm c̣n lại và là nguyên nhân làm cho định lượng không có giá trị. Kiểm tra giả thuyết trên bằng phép kiểm tra Dunnett:

Đối với chế phẩm U:

                                   

Đối với chế phẩm Z:

                                   

Đối với chế phẩm Z, > t’ = 2,27 đọc từ Bảng 3.2.4.-II với P = 0,05, f1 = 2 và f2 = 54, do đó đường ln(liều) – đáp ứng của nó không song song với đường ln(liều) – đáp ứng của chế phẩm chuẩn. Loại các số liệu liên quan đến chế phẩm Z và lặp lại phân tích chỉ với chế phẩm U và chế phẩm chuẩn, với .

                                                             

                                   

Bảng 3.2.8.1.-IV – Phân tích phương sai không có chế phẩm Z

Nguồn gây sai số

Bậc tự do

Tổng các b́nh phương

B́nh phương trung b́nh

Tỷ số F

Xác suất

Chế phẩm

1

390,6

390,6

 

 

Hồi qui tuyến tính

1

66.830,6

66.830,6

90,5

< 0,01

Không song song

1

34,2

34,2

0,05

> 0,05

Giữa các xử lư

3

67.255,5

 

 

 

Sai số dư

36

26.587,3

738,54

 

 

Sai số toàn phần

39

93.842,8

 

 

 

Sau khi loại chế phẩm Z, kết quả phân tích phương sai cho thấy định lượng có giá trị thống kê.

Tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy

                                   

                                   

Tỷ lệ giữa các liều kế tiếp nhau bằng 1,0/0,25 = 4, do đó I = ln(4) = 1,3863, t = 2,03 với P = 0,95 và f = 36 (Bảng 5.1). 

                                   

Hoạt lực giả định AU của chế phẩm U là 1 đơn vị/mg, do đó:

                                   

Hoạt lực của chế phẩm U bằng antiln (MU) = antiln (0,1060) = 1,11 đơn vị/mg.

                                   

                                   

Logarithm các giới hạn tin cậy bằng:

Các giới hạn tin cậy là 0,82 và 1,51 đơn vị/mg.

Ví dụ 3.2.8.2. Định lượng 3 liều với một chế phẩm thử, bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối không lặp

Định lượng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán dùng hộp Petri

Các dung dịch thử của chế phẩm chuẩn s1, s2s3 có nồng độ lần lượt là 2, 4 và 8 IU/ml. Chế phẩm thử có hoạt lực giả định là 1.500 IU/ml và cũng được pha thành 3 dung dịch thử u1, u2u3 có nồng độ tương đương với nồng độ các dung dịch thử của chế phẩm chuẩn. Mỗi hộp Petri đều có 3 dung dịch thử của chế phẩm chuẩn và 3 dung dịch thử của chế phẩm thử, trong đó mỗi dung dịch thử chỉ xuất hiện một lần duy nhất (không lặp). Trật tự sắp xếp các dung dịch thử trong mỗi hộp hoàn toàn ngẫu nhiên và không giống nhau giữa các hộp (xem Bảng 3.2.8.2.-I).

Các đáp ứng riêng và đáp ứng trung b́nh của mỗi dung dịch thử cho ở Bảng 3.2.8.2.-II. 

Bảng 3.2.8.2.-I – Cách bố trí các dung dịch thử

Hộp số

Trật tự sắp xếp các nồng độ của SU trong mỗi hộp Petri

1

u2

u3

s3

s1

u1

s2

2

s3

u1

s2

u3

s1

u2

3

u3

u2

s1

s3

s2

u1

4

s1

s2

u3

u1

u2

s3

5

u1

s1

u2

s2

s3

u3

6

s2

s3

u1

u2

u3

s1

 

Bảng 3.2.8.2.-II - Đáp ứng y – đường kính ṿng vô khuẩn ( )

 

Hộp số

Chế phẩm chuẩn S

 

Chế phẩm thử U

Tổng khối

s1

s2

s3

 

u1

u2

u3

1

176

205

235

 

174

202

232

R1 = 1224

2

178

208

238

 

175

206

234

R2 = 1239

3

178

207

237

 

177

203

236

R3 = 1238

4

175

205

235

 

173

201

232

R4 = 1221

5

176

206

235

 

174

204

231

R5 = 1226

6

174

204

236

 

170

202

229

R6 = 1215

Trung b́nh

176,2

205,8

236,0

 

173,8

203,0

232,3

 

Phương sai

2,6

2,2

1,6

 

5,4

3,2

5,9

 

 

Kiểm tra số liệu thu được bằng các phép kiểm tra tương tự như ở ví dụ 3.2.8.1 cho thấy định lượng đáp ứng các điều kiện ở mục 3.1.1.

                                                                 

                                   

Bảng 3.2.8.2.-III – Các tổng đáp ứng và tương phản tuyến tính (xem công thức tính ở Bảng 3.2.3.-II)

 

Chế phẩm chuẩn S

Chế phẩm thử U

Tổng số

Liều thấp

S1 = 1.075

U1 = 1.043

 

Liều trung b́nh

S2 = 1.235

U2 = 1.218

 

Liều cao

S3 = 1.416

U3 = 1.394

 

Tổng đáp ứng của chế phẩm

S = 3.708

U = 3.655

Tương phản tuyến tính

LS = 359

LU = 351

Tương phản bậc hai

QS = 3

QU = 1

 

Các tổng các b́nh phương được tính bằng các công thức trong Bảng 3.2.3.-IV và 3.2.3.-V với các giá trị ở Bảng 3.2.8.2.-III.

Chế phẩm                                   

Hồi qui tuyến tính =

Không song song =

Độ cong =

Giữa các xử lư =

Giữa các khối =

Toàn phần =

Sai số dư = Toàn phần – Giữa các xử lư – Giữa các khối = 28,03

Bảng 3.2.8.2.-IV – Phân tích phương sai

Nguồn gây sai số

Bậc tự do

Tổng các b́nh phương

B́nh phương trung b́nh

Tỷ số F

Xác suất

Chế phẩm

1

78,03

78,03

 

 

Hồi qui tuyến tính

1

21.004,17

21.004,17

18.737

< 0,01

Không song song

1

2,67

2,67

2,4

> 0,05

Độ cong

2

0,28

0,16

0,1

> 0,05

Giữa các xử lư

5

21.085,14

 

 

 

Giữa các khối (hộp Petri)

5

75,80

15,16

13,5

< 0,01

Sai số dư

25

28,03

1,121

 

 

Sai số toàn phần

35

21.188,97

 

 

 

Kết quả phân tích phương sai cho thấy sự khác nhau có ư nghĩa (P < 0,01) của kích thước đường kính ṿng vô khuẩn giữa các hộp Petri. Nếu thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, sai số giữa các khối sẽ không được tách ra khỏi sai số toàn phần, do đó sai số dư s2 sẽ lớn hơn, dẫn đến khoảng tin cậy sẽ rộng hơn. Đây là ưu điểm của bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối so với bố trí thí nghiệm kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.

Kiểm tra giá trị của định lượng

Hồi qui tuyến tính rất có ư nghĩa (P < 0,01), các đại lượng không song song và độ cong không có ư nghĩa (P > 0,05), do đó định lượng có giá trị thống kê.

Tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy

                                      

Tỷ lệ giữa các nồng độ kế tiếp bằng 2,0, do đó:

                                   

Với P = 0,95 và f = 25, t = 2,06 (Bảng 5.1).

                                   

                                   

                                   

Hoạt lực của chế phẩm UR = antiln(M) = 1.400 IU/ml.

                                   

                                   

Các ln(giới hạn tin cậy) bằng:

Các giới hạn tin cậy bằng 1.378 và 1.423 IU/ml.

Nếu phân tích bằng máy tính, các kết quả sẽ là:

Khoảng tin cậy: 1.376,3 – 1.424,1 IU/ml.

Ví dụ 3.2.8.3. Định lượng 3 liều với một chế phẩm thử, bố trí thí nghiệm theo h́nh vuông Latin không lặp

Định lượng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán, dùng khay vuông

Chế phẩm chuẩn có hoạt lực biết trước 4.855 IU/mg. Chế phẩm thử có hoạt lực giả định là 5.600 IU/mg. Pha các dung dịch gốc bằng cách ḥa tan 25,2 mg chế phẩm chuẩn và 21,4 mg chế phẩm thử trong lượng vừa đủ dung môi pha loăng để được 25 ml. Sau đó, pha loăng các dung gốc đến nồng độ pha loăng 1/20 và tiếp tục pha loăng xa hơn với tỷ lệ pha loăng 1:1,5 để được các dung dịch thử cuối cùng của chuẩn và mẫu.

Các dung dịch thử của chuẩn và mẫu được bố trí trên khay theo bố trí thí nghiệm h́nh vuông Latin như trong Bảng 3.2.8.3.-I. Các đường kính ṿng vô khuẩn của định lượng tŕnh bày trong Bảng 3.2.8.3.-II. Trung b́nh đường kính ṿng vô khuẩn, phương sai (vari) và ln(vari) của mỗi nhóm dung dịch thử tŕnh bày trong Bảng 3.2.8.3.-III.

Bảng 3.2.8.3.-I. Cách bố trí các dung dịch thử trên khay

 

1

2

3

4

5

6

1

s1

u1

u2

s3

s2

u3

2

u1

u3

s1

s2

u2

s3

3

u2

s3

s2

s1

u3

u1

4

s3

s2

u3

u1

s1

u2

5

s2

u2

s3

u3

u1

s1

6

u3

s1

u1

u2

s3

s2

Kiểm tra tính đồng nhất của các phương sai

Đối với một nhóm gồm k phương sai, trong đó mỗi phương sai có f  = ( n – 1) bậc tự do, công thức tính sẽ như sau:

                                     

Với k = 6, bậc tự do  f = 5, công thức trên sẽ rút gọn thành:

                                   

Giá trị tính được nhỏ hơn giá trị tới hạn 11,07 đọc từ Bảng 5.2 với P = 0,95 và f = (k – 1) = 5. Do đó, sự khác biệt giữa các phương sai của mỗi nhóm dung dịch thử không có ư nghĩa thống kê.

 

Bảng 3.2.8.3.-II Đáp ứng y – đường kính ṿng vô khuẩn ( )

 

1

2

3

4

5

6

Tổng hàng

1

161

160

178

187

171

194

R1 = 1.051

2

151

192

150

172

170

192

R2 = 1.027

3

162

195

174

161

193

151

R3 = 1.036

4

194

184

199

160

163

171

R4 = 1.071

5

176

181

201

202

154

151

R5 = 1.065

6

193

166

161

186

198

182

R6 = 1.086

Tổng cột

C1 = 1.037

C2 = 1.078

C3 = 1.063

C4 = 1.068

C5 = 1.049

C6 = 1.041

 

Bảng 3.2.8.3.-III Trung b́nh đường kính ṿng vô khuẩn và phương sai của mỗi nhóm dung dịch thử

 

Chế phẩm chuẩn S

 

Chế phẩm thử U

Tổng số

 

s1

s2

s3

 

u1

u2

u3

 

161

171

187

 

160

178

194

 

 

150

172

192

 

151

170

192

 

 

161

174

195

 

151

162

193

 

 

163

184

194

 

160

171

199

 

 

151

176

201

 

154

181

202

 

 

166

182

198

 

161

186

193

 

Trung b́nh

158,67

176,50

194,50

 

156,17

174,67

195,50

 

Phương sai (vari)

43,47

28,70

23,50

 

22,17

75,07

16,30

ln (vari)

3,772

3,357

3,157

 

3,099

4,318

2,791

Bảng 3.2.8.3.-IV – Các tổng đáp ứng và tương phản tuyến tính (xem công thức tính ở Bảng 3.2.3.-II)

 

Chế phẩm chuẩn S

Chế phẩm thử U

Tổng số

Liều thấp

S1 = 952

U1 = 937

 

Liều trung b́nh

S2 = 1.059

U2 = 1.048

 

Liều cao

S3 = 1.167

U3 = 1.173

 

Tổng đáp ứng của chế phẩm

S = 3.178

U = 3.158

 

Tương phản tuyến tính

LS = 215

LU = 236

 

Tương phản bậc hai

QS = 1

QU = 14

 

                                 

                                   

Các tổng các b́nh phương được tính bằng các công thức trong Bảng 3.2.3.-IV và 3.2.3.-V với các giá trị ở Bảng 3.2.8.3.-II và Bảng 3.2.8.3.-IV.

Chế phẩm                                    

Hồi qui tuyến tính =

Không song song =

Độ cong (không tuyến tính) =

Giữa các xử lư =

Giữa các hàng =

Giữa các cột =

Toàn phần =

Sai số dư = Toàn phần – Giữa các xử lư – Giữa các hàng – Giữa các cột = 415,3333

Bảng 3.2.8.3.-V – Phân tích phương sai

Nguồn gây sai số

Bậc tự do

Tổng các b́nh phương

B́nh phương trung b́nh

Tỷ số F

Xác suất

Chế phẩm

1

11,1111

11,1111

 

 

Hồi qui tuyến tính

1

8.475,0417

8.475,0417

408,1

< 0,01

Không song song

1

18,3750

18,3750

0,885

> 0,05

Độ cong

2

5,4722

2,7361

0,132

> 0,05

Giữa các xử lư

5

8510

 

 

 

Giữa các hàng

5

412

82,40

3.968

< 0,05

Giữa các cột

5

218,6667

43,73

2,106

> 0,05

Sai số dư

20

415,3333

20,7667

 

 

Sai số toàn phần

35

9.556

 

 

 

Phân tích phương sai cho thấy sự khác nhau có ư nghĩa (P < 0,05) giữa các hàng chứng tỏ bố trí thí nghiệm h́nh vuông Latin cho độ chính xác cao hơn bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên hoàn toàn.

Kiểm tra tính có giá trị của định lượng

Hồi qui tuyến tính rất có ư nghĩa (P < 0,01), độ lệch khỏi tính tuyến tính và tính song song của các đường ln(liều) – đáp ứng không có ư nghĩa (P > 0,05), do đó định lượng thỏa măn các phép kiểm tra tính có giá trị.

Tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy

Tỷ lệ giữa các nồng độ kế tiếp nhau bằng 1,5, do đó I = ln(1,5) = 0,405465. Với P = 0,95 và f = 20, t = 2,09 (Bảng 5.1).

                                     

                                   

                                   

                                   

                                   

Hoạt lực của chế phẩm UR = antiln(M) = 5.467,3 IU/mg.

                                   

                                   

Các ln(giới hạn tin cậy) được tính theo công thức:

Các giới hạn tin cậy bằng 5.102,6 và 5.855,1 IU/mg.

V́ các dung dịch gốc của chế phẩm chuẩn và chế phẩm thử không hoàn toàn bằng nhau, cần hiệu chỉnh hoạt lực tính được và các giới hạn tin cậy bằng cách nhân với một hệ số hiệu chỉnh:

Sau khi hiệu chỉnh, hoạt lực tính được sẽ bằng 5.582 IU/mg với giới hạn tin cậy từ 5.209 đến 5.977 IU/mg ở xác suất 95 %.

Ví dụ 3.2.8.4. Định lượng chéo đôi

Định lượng insulin bằng phương pháp tiêm dưới da thỏ

Các dung dịch thử của chế phẩm chuẩn có nồng độ 1 và 2 IU/ml. Hoạt lực giả định của chế phẩm thử là 40 IU/ml và được pha loăng thành các dung dịch thử có nồng độ tương đương với các dung dịch thử của chế phẩm chuẩn. Tiêm dưới da các thỏ thí nghiệm với liều 0,5 ml mỗi dung dịch thử theo sơ đồ ở Bảng 3.2.8.4.-I. Các kết quả thí nghiệm tŕnh bày trong Bảng 3.2.8.4.-II. Phương sai lớn cho thấy đáp ứng không đồng nhất của các thỏ thí nghiệm với hoạt chất cần định lượng và giải thích cho sự cần thiết phải dùng bố trí thí nghiệm chéo.

Bảng 3.2.8.4.-I – Cách sắp xếp các xử lư

Ngày thí nghiệm

Nhóm thỏ

1

2

3

4

Ngày I

s1

s2

u1

u2

Ngày II

u2

u1

s2

s1

Kiểm tra tính đồng nhất của các phương sai bằng phép kiểm tra Hartley

Tính tỷ số F theo công thức:

                                     

Trong đó varmax. là phương sai lớn nhất và varmin. là phương sai nhỏ nhất trong k phương sai cần kiểm tra. F tính được nhỏ hơn F tới hạn bằng 12,7 đọc từ Bảng 5.3 với P = 0,95, k = 8 và bậc tự do f = 7. Do đó, sự khác nhau giữa các phương sai của mỗi nhóm dung dịch thử không có ư nghĩa thống kê. Nếu dùng phép kiểm tra Bartlett với cùng số liệu, giá trị tính được sẽ là 6,4 so với giá trị tới hạn bằng 14,1.

Trong các định lượng bố trí thí nghiệm chéo, các tổng đáp ứng và tương phản tuyến tính được tính riêng rẽ cho mỗi giai đoạn thí nghiệm. Kết quả tính toán tŕnh bày trong Bảng 3.2.8.4.-III.

Bảng 3.2.8.4.-II – Đáp ứng y: glucose huyết (mg/100 ml) ở 1 và 1½  giờ  

 

Nhóm 1

Nhóm 2

Nhóm 3

Nhóm 4

 

s1

u2

Tổng số

s2

u1

Tổng số

u1

s2

Tổng số

u2

s1

Tổng số

 

112

104

216

65

72

137

105

91

196

118

144

262

 

126

112

238

116

160

276

83

67

150

119

149

268

 

62

58

120

73

72

145

125

67

192

42

51

93

 

86

63

149

47

93

140

56

45

101

64

107

171

 

52

53

105

88

113

201

92

84

176

93

117

210

 

110

113

223

63

71

134

101

56

157

73

128

201

 

116

91

207

50

65

115

66

55

121

39

87

126

 

101

68

169

55

100

155

91

68

159

31

71

102

Trung b́nh

95,6

82,8

 

69,6

93,3

 

89,9

66,6

 

72,4

106,8

 

Phương sai

709,7

627,9

 

525,1

1.012,5

 

479,6

230,6

 

1.214,3

1.215,1

 

Bảng 3.2.8.4.-III – Các tổng đáp ứng và tương phản tuyến tính

 

Chế phẩm chuẩn S

Chế phẩm thử U

Tổng số

Ngày I

 

 

 

      Nồng độ thấp

S1I = 765

U1I = 719

 

      Nồng độ cao

S2I = 557

U2I = 579

 

      Tổng số

SI = 1.322

UI = 1.298

DI = 2.620

 

 

 

 

Ngày II

 

 

 

      Nồng độ thấp

S1II = 854

U1II = 746

 

      Nồng độ cao

S2II = 533

U2II = 662

 

      Tổng số

SII = 1.387

UII = 1.408

DII = 2.795

 

 

 

 

Tổng chế phẩm

S = 2.709

U = 2.706

 

 

 

 

Tương phản tuyến tính

 

 

 

      Ngày I

LSI = -208

LUI = -140

LI = -348

      Ngày II

LSII = -321

LUII = -84

LII = -405

      Tổng số

LS = -529

LU = -224

Phân tích phương sai trong các định lượng bố trí thí nghiệm chéo phức tạp hơn các kiểu bố trí thí nghiệm khác do độ phân tán, biểu diễn bằng tổng các b́nh phương, gây bởi tính song song không độc lập với độ phân tán giữa các đơn vị thí nghiệm (trong ví dụ này là thỏ). Tính song song của các đường hồi qui sẽ được kiểm tra bằng một đại lượng sai số b́nh phương trung b́nh phụ, được tính bằng cách lấy tổng các b́nh phương giữa các thỏ thí nghiệm trừ đi thành phần song song và hai thành phần tương tác.

Ba thành phần tương tác được đưa thêm vào phân tích phương sai gây bởi sự lặp lại trong mỗi nhóm thỏ thí nghiệm, gồm:

giữa các ngày chế phẩm; giữa các ngày  hồi qui; giữa các ngày  tính song song.

Ba đại lượng này biểu thị khuynh hướng biến thiên từ ngày thí nghiệm này sang ngày thí nghiệm khác của các nguồn gây sai số do chế phẩm, hồi qui và tính song song. Giá trị thống kê của định lượng phụ thuộc vào mức ư nghĩa của các tỷ số F tương ứng của ba đại lượng nói trên. Nếu F tính được rất có ư nghĩa, Fcal. > Fcrit. P = 0,01, cần phải rất thận trọng khi suy diễn các kết quả của định lượng, nếu có thể, phải lặp lại định lượng.  

                                   

                                   

Tính giá trị của tổng các b́nh phương của chế phẩm, hồi qui và không song song theo công thức trong Bảng 3.2.3.-IV với số liệu trong Bảng 3.2.8.4.-III.

Chú ư trong định lượng này n = 16, là tổng số đáp ứng của mỗi xử lư qua hai ngày thí nghiệm.

Chế phẩm                                      

Hồi qui tuyến tính =

Không song song =

Giữa các khối (thỏ) =

trong đó Bi là các tổng đáp ứng của mỗi thỏ thí nghiệm trong Bảng 3.2.8.4.-II.

Giữa các ngày =

trong đó DIDII là tổng đáp ứng của mỗi ngày thí nghiệm.

Giữa các ngày  Chế phẩm =

trong đó SI, SII, UIUII là tổng đáp ứng của từng chế phẩm trong mỗi ngày.

Giữa các ngày  hồi qui =

Giữa các ngày  Không song song =

trong đó LSI, LSII, LUILUII là tương phản tuyến tính của mỗi ngày thí nghiệm.

Toàn phần =

Sai số dư giữa các thỏ = Giữa các khối – Không song song – (giữa các ngày  chế phẩm) – (giữa các ngày  hồi qui) = 39.794,73 – 1.453,51 – 31,64 – 50,76  = 38.258,81

Sai số dư trong mỗi thỏ = Toàn phần – Giữa các khối – Giữa các ngày – Chế phẩm – Hồi qui – (giữa các ngày  không song song) = 53.423,23 – 39.794,73 – 478,51 – 0,14 – 8.859,52 – 446,27 = 3.844,06

Tính có giá trị của định lượng

Phân tích phương sai cho thấy định lượng thỏa măn phép kiểm tra tính có giá trị:

1)   Hồi qui tuyến tính rất có ư nghĩa: tỷ số F của đại lượng hồi qui được tính dựa trên sai số b́nh phương trung b́nh trong mỗi thỏ, Fcal. = 64,5 > Fcrit. = 7,63 với P = 0,01, f1 = 1 và f2 = 28.

2)   Tính song song của đường hồi qui: phép kiểm tra tính song song trong định lượng chéo dựa trên sai số b́nh phương trung b́nh giữa các thỏ, Fcal. = 1,06 < F(P = 0,05, f1 = 1, f2 = 28) = 4,19, chứng tỏ các đường ln(liều) – đáp ứng của chuẩn và mẫu song song với nhau.

3)   Ba thành phần tương tác đều không có ư nghĩa, các tỷ số F tính được lần lượt là 0,02, 0,04 và 3,25 và đều nhỏ hơn Fcrit. = 4,19.

 

Bảng 3.2.8.4.-IV – Phân tích phương sai

Nguồn gây sai số

Bậc tự do

Tổng các b́nh phương

B́nh phương trung b́nh

Tỷ số F

Xác suất

Không song song

1

1.453,5

1.453,5

1,06

> 0,05

Giữa các ngày  chế phẩm

1

31,6

31,6

0,02

> 0,05

Giữa các ngày  hồi qui

1

50,8

50,8

0,04

> 0,05

Sai số dư giữa các thỏ

28

38.258,8

1.366,4

 

 

Giữa các khối (thỏ)

31

39.794,7

1.283,7

 

 

Chế phẩm

1

0,1

0,1

0,00

> 0,05

Hồi qui

1

8.859,5

8.859,5

64,5

< 0,01

Giữa các ngày

1

478,5

478,5

3,48

> 0,05

Giữa các ngày  không song song

1

446,3

446,3

3,25

> 0,05

Sai số dư trong mỗi thỏ

28

3.844,1

137,3

 

 

Toàn phần

63

53.423,2

847,9878472

 

 

Tính hoạt lực và các giới hạn tin cậy

Tỷ lệ pha loăng bằng 2, do đó I = ln(2) = 0,69315. Với P = 0,95 và f = 28, t = 2,05 (Bảng 5.1).

                       

                       

                       

                       

Hoạt lực R = antiln(M) = antiln(0,00276) = 40,1 IU/ml.

                       

Logarithm các giới hạn tin cậy bằng:

                       

Giới hạn tin cậy của hoạt lực từ 33,4 đến 48,2 IU/ml.

4. Phối hợp các kết quả định lượng

4.1. Mở đầu

Để đáp ứng các yêu cầu của Dược điển, ví dụ yêu cầu về độ chính xác, có thể phải lặp lại hai hay nhiều định lượng độc lập và phối hợp các kết quả định lượng để được kết quả cuối cùng chính xác và đáng tin cậy hơn.

Hai định lượng được coi là độc lập với nhau nếu quá tŕnh thực hiện của mỗi định lượng không gây bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quả của định lượng khác. Điều đó có nghĩa là các sai số ngẫu nhiên của các yếu tố chủ yếu có thể ảnh hưởng đến kết quả định lượng (ví dụ: sự chuẩn bị các dung dịch thử của chuẩn và mẫu thử, độ nhạy của chỉ thị sinh học) của một định lượng phải độc lập với các sai số ngẫu nhiên tương ứng của định lượng kia. Các định lượng thực hiện vào những ngày kế tiếp nhau dùng cùng dung dịch gốc của chế phẩm chuẩn không phải là những định lượng độc lập.

Có nhiều phương pháp phối hợp kết quả của các định lượng độc lập, tuy nhiên, dưới đây chỉ tŕnh bày ba phương pháp gần đúng do tính đơn giản và dễ áp dụng của chúng.

Trước khi phối hợp, các hoạt lực phải được hiệu chỉnh với hoạt lực giả định của mỗi chế phẩm thử (xem ví dụ 3.2.8.3) và phải được biểu diễn dưới dạng logarithm.

4.2. Phối hợp cân chỉnh các kết quả định lượng (weighted combination)

Phương pháp này có thể áp dụng nếu thỏa măn các điều kiện sau:

1)   các định lượng phải độc lập với nhau;

2)   đại lượng C của mỗi định lượng phải nhỏ hơn 1,1 (xem công thức 3.2.5-6 để biết công thức tính và ư nghĩa của C);

3)   bậc tự do của sai số dư của mỗi định lượng phải lớn hơn 6, tốt nhất là lớn hơn 15;

4)   sự khác nhau giữa các hoạt lực cần phối hợp phải không có ư nghĩa thống kê (xem mục 4.2.2).

Nếu các điều kiện trên không thỏa măn, dùng phương pháp giới thiệu ở mục 4.3 để tính hoạt lực trung b́nh và lấy kết quả tính được làm hoạt lực giả định cho lần định lượng kế tiếp.

4.2.1. Tính các hệ số cân chỉnh W

Giả sử các kết quả đo của mỗi n’ định lượng đă được phân tích để được n’ giá trị logarithm hoạt lực M và các giới hạn tin cậy tương ứng. Đối với mỗi định lượng, tính logarithm khoảng giới hạn tin cậy L bằng cách lấy logarithm giới hạn tin cậy trên trừ đi logarithm giới hạn tin cậy dưới. Tính hệ số W cho mỗi giá trị M theo phương tŕnh 4.2.1.-1, với t là số Student đă dùng khi tính các giới hạn tin cậy.

                                                                                                                      (4.2.1.-1)

4.2.2. Tính đồng nhất của các hoạt lực

Để kiểm tra tính đồng nhất của một dăy các hoạt lực, thành lập biểu thức có phân phối xấp xỉ phân phối như sau:

                                                             (4.2.2.-1)

với:                                

Nếu tính được nhỏ hơn giá trị tương ứng với bậc tự do f = (n’ – 1) tra từ Bảng 5.2, sự khác nhau giữa các hoạt lực không có ư nghĩa thống kê và, do đó, có thể tiếp tục tính hoạt lực trung b́nh và các giới hạn tin cậy theo các công thức ở mục 4.2.3.

Nếu tính được lớn hơn giá trị tới hạn tương ứng đọc từ Bảng 5.2, các hoạt lực tính được không đồng nhất và không thể sử dụng các công thức ở mục 4.2.3, thay vào đó, có thể dùng các công thức ở mục 4.2.4.

4.2.3. Tính hoạt lực trung b́nh có cân chỉnh (weighted mean) và các giới hạn tin cậy

Logarithm hoạt lực trung b́nh được tính theo công thức:

                                                                                                              (4.2.3.-1)           

Độ lệch chuẩn của logarithm hoạt lực trung b́nh là căn bậc hai của nghịch đảo của tổng các hệ số W:

                                                                                                             (4.2.3.-2)

và các logarithm giới hạn tin cậy của hoạt lực trung b́nh được tính theo phương tŕnh sau:

                                                                                                                    (4.2.3.-3)

trong đó t là số Student đọc từ Bảng 5.2 với bậc tự do bằng tổng số bậc tự do của các sai số dư của mỗi định lượng.

4.2.4. Hoạt lực trung b́nh có cân chỉnh và các giới hạn tin cậy dựa trên độ phân tán trong mỗi định lượng và giữa các định lượng

Khi phối hợp các kết quả của một số định lượng lặp lại, giá trị có thể có ư nghĩa. Độ phân tán của các hoạt lực có thể phân tích thành hai thành phần, gồm:

1) Phương sai trong mỗi định lượng  

2) Phương sai giữa các định lượng  

với là trung b́nh chưa cân chỉnh (trung b́nh số học) của các M. Phương sai đầu thay đổi từ định lượng này đến định lượng khác, trong khi phương sai sau là chung cho tất cả các M.

Đối với mỗi M tính hệ số cân chỉnh theo công thức:

                                   

Dùng W’ thay thế cho W trong các công thức ở mục 4.2.3, với t = 2.

4.3. Phối hợp không  cân chỉnh các kết quả định lượng (unweighted combination)

Phương pháp phối hợp các kết quả định lượng đơn giản nhất là tính trung b́nh số học của n’ logarithm hoạt lực M và sau đó tính độ lệch chuẩn của nó theo công thức:

                                                                                                        (4.3.-1)

các logarithm giới hạn tin cậy bằng:

                                                                                                                       (4.3.-2)

trong đó t có (n’ – 1) bậc tự do. V́ số các định lượng cần phối hợp thường nhỏ nên giá trị của t khá lớn.

4.4. Ví dụ

Bảng 4.4.-1 liệt kê kết quả sáu định lượng độc lập cùng với các giới hạn tin cậy và bậc tự do của sai số dư tương ứng. Tất cả các định lượng đều đáp ứng điều kiện 1, 2 và 3 trong mục 4.2. Các hệ số W được tính theo công thức ở mục 4.2.

Kiểm tra tính đồng nhất của các hoạt lực

tính được nhỏ hơn giá trị tới hạn bằng 11,07 đọc từ Bảng 5.2 với bậc tự do f = 5. Do đó, sự khác nhau giữa các hoạt lực không có ư nghĩa thống kê.

Bảng 4.4.-I – Hoạt lực và các giới hạn tin cậy của sáu định lượng độc lập

 Lần định lượng

Hoạt lực R
(IU/lọ)

Các giới hạn tin cậy (IU/lọ)

Bậc tự do
DF

Giới hạn dưới

Giới hạn trên

1

18.367

17.755

19.002

20

2

18.003

17.415

18.610

20

3

18.064

17.319

18.838

20

4

17.832

17.253

18.429

20

5

18.635

17.959

19.339

20

6

18.269

17.722

18.834

20

Tổng số

 

 

 

120

Bảng 4.4.-II.

 

M = ln(R)

L*

W

MW

WM2

 

9,8183

0,0679

3.777,8301

37.091,9101

364.179,9033

 

9,7983

0,0664

3.951,6825

38.719,7456

379.387,4392

 

9,8017

0,0841

2.462,5579

24.137,1950

236.584,9721

 

9,7887

0,0659

4.003,1116

39.185,4586

383.576,6531

 

9,8328

0,0740

3.175,7400

31.226,4061

307.042,9060

 

9,8130

0,0609

4.699,6807

46.117,7833

452.552,0054

Tổng số

58,8528

 

22.070,6028

216.478,4988

2.123.323,8792

* L = ln(giới hạn tin cậy trên) – ln(giới hạn tin cậy dưới)

Hoạt lực trung b́nh và các giới hạn tin cậy

Hoạt lực trung b́nh và các giới hạn tin cậy của nó được tính bằng các công thức ở mục 4.2.3 và các số liệu trong Bảng 4.4.-I và 4.4.-II.

                                   

Với số bậc tự do f = 120, P = 0,95, t = 1,98.

                                   

Bằng cách lấy antilogarithm các giá trị tính được, hoạt lực trung b́nh bằng 18.187 IU/lọ với khoảng tin cậy ở xác suất 95 % từ 17.946 đến 18.431 IU/lọ.

 

 

5. Các Bảng tra cứu

5.1. Bảng mức ư nghĩa của t (giá trị tuyệt đối)

 

P

 

P

f

0,95

0,99

f

0,95

0,99

1

12,71

63,66

18

2,10

2,88

2

4,30

9,92

19

2,09

2,86

3

3,18

5,84

20

2,09

2,85

4

2,78

4,60

21

2,08

2,83

5

2,57

4,03

22

2,07

2,82

6

2,45

3,71

23

2,07

2,81

7

2,36

3,50

24

2,06

2,80

8

2,31

3,36

25

2,06

2,79

9

2,26

3,25

26

2,06

2,78

10

2,23

3,17

27

2,05

2,77

11

2,20

3,11

28-29

2,05

2,76

12

2,18

3,05

30

2,04

2,75

13

2,16

3,01

40-43

2,02

2,7

14

2,14

2,98

57-63

2,00

2,66

15

2,13

2,95

102-126

1,98

2,26

16

2,12

2,92

600-∞

1,96

2,58

17

2,11

2,90

 

 

 

Nếu giá trị quan sát lớn hơn giá trị trong bảng, nó được coi là có ư nghĩa (P = 0,95) hay rất có ư nghĩa (P = 0,99).

5.2. Bảng mức ư nghĩa của

 

P

 

P

f

0,05

0,01

f

0,05

0,01

1

3,84

6,63

11

19,68

24,73

2

5,99

9,21

12

21,03

26,22

3

7,81

11,34

13

22,36

27,69

4

9,49

13,28

14

23,68

29,14

5

11,07

15,09

15

25,00

30,58

6

12,59

16,81

16

26,30

32,00

7

14,07

18,48

20

31,41

37,57

8

15,51

20,09

25

37,65

44,31

9

16,92

21,67

30

43,77

50,89

10

18,31

23,21

40

55,76

63,69

Nếu giá trị quan sát lớn hơn giá trị trong bảng, nó được coi là có ư nghĩa (P = 0,95) hay rất có ư nghĩa (P = 0,99).

5.3. Mức ư nghĩa của tỷ số F = varmax/varmin của k phương sai trong nhóm xử lư, mỗi phương sai có f bậc tự do (Hartley’s test).

k

 

 

 

 

 

 

f

4

6

8

9

10

12

4

20,6

29,5

37,5

41,1

44,6

51,4

 

49

69

89

97

106

120

 

 

 

 

 

 

 

5

13,7

18,7

22,9

24,7

26,5

29,9

 

28

38

46

50

54

60

 

 

 

 

 

 

 

6

10,4

13,7

16,3

17,5

18,6

20,7

 

19,1

25

30

32

34

37

 

 

 

 

 

 

 

7

8,44

10,8

12,7

13,5

14,3

15,8

 

14,5

18,4

22

23

24

27

 

 

 

 

 

 

 

8

7,18

9,03

10,5

11,1

11,7

12,7

 

11,7

14,5

16,9

17,9

18,9

21

 

 

 

 

 

 

 

9

6,31

7,80

8,95

9,45

9,91

10,7

 

9.9

12,1

13,9

14,7

15,3

16,6

 

 

 

 

 

 

 

10

5,67

6,92

7,87

8,28

8,66

9,34

 

8,6

10,4

11,8

12,4

12,9

13,9

Nếu F tính được lớn hơn giá trị trong bảng, biến số cần kiểm tra được coi là có ư nghĩa (ḍng trên, P = 0,05), hay rất có ư nghĩa (ḍng dưới, P = 0,01).

6. Các kư hiệu thuật ngữ

Kư hiệu

Định nghĩa

b

Độ dốc hồi qui tuyến tính của đường thẳng liều – đáp ứng hay ln(liều) – đáp ứng của tất cả các chế phẩm trong một định lượng

d

Số liều của mỗi chế phẩm trong một định lượng đối xứng.

e

cơ số của logarithm tự nhiên. e = 2,718281828….

f

số bậc tự do

h

số chế phẩm trong một định lượng, bao gồm cả chế phẩm chuẩn

k

số xử lư trong một định lượng, k = dh

n

số đáp ứng hay số lần lặp lại của mỗi xử lư

n’

số các ước lượng hoạt lực

s

độ lệch chuẩn,

s1,s2,s3

Nồng độ thấp, trung b́nh và cao của chế phẩm S, trong một định lượng chỉ có 2 nồng độ của mỗi chế phẩm s2 đại diện cho nồng độ cao

s2

ước lượng của sai số dư được tính từ sai số b́nh phương trung b́nh. là phương sai của logarithm hoạt lực M

t

thống kê Student (Bảng 5.1)

t’

thống kê Dunnett (Bảng 3.2.4.-II)

u1…z3

Nồng độ các dung dịch thử của chế phẩm cần định lượng UZ

y

đáp ứng riêng hay đáp ứng riêng đă được biến đổi

y’

đáp ứng tính được dùng để thay thế cho giá trị bị mất

đáp ứng trung b́nh của chế phẩm chuẩn và các chế phẩm thử

AU…AZ

hoạt lực giả định của các chế phẩm cần định lượng, là hoạt lực được dùng để tính lượng chế phẩm cần lấy khi pha các dung dịch thử

B1…B2n

tổng đáp ứng của mỗi đơn vị thí nghiệm (1 đến n) trong định lượng chéo đôi

B’

tổng đáp ứng của khối hay hàng có chứa giá trị bị mất

C

đại lượng biểu thị ư nghĩa của hồi qui, dùng trong tính toán các giới hạn tin cậy (phương tŕnh 3.2.5-5). Trong một số tài liệu thống kê định lượng sinh học, ư nghĩa của hồi qui được biểu thị bằng g:

                                   

C1…Cn

tổng đáp ứng của mỗi cột (1 đến n) trong bố trí thí nghiệm h́nh vuông Latin

C’

tổng đáp ứng của cột có chứa giá trị bị mất trong bố trí thí nghiệm h́nh vuông Latin

D

liều

DI,DII

tổng đáp ứng của giai đoạn I và giai đoạn II trong định lượng chéo đôi

E

tổng các b́nh phương của đại lượng hồi qui (Bảng 3.2.3.-IV)

F

tỷ số của hai ước lượng phương sai độc lập (Bảng 3.2.4.-I)

G’

tổng đáp ứng trong một định lượng có giá trị bị mất

I

khoảng cách giữa các ln(liều) kế tiếp nhau, ví dụ I = ln(S2) – ln(S1)

K

đại lượng được dùng để tính tổng các b́nh phương trong phân tích phương sai

                                   

L

độ rộng của logarithm giới hạn tin cậy, L = ln(giới hạn tin cậy trên) – ln(giới hạn tin cậy dưới)

LS…LZ

tương phản tuyến tính của chế phẩm chuẩn và các chế phẩm thử (Bảng 3.2.3.-I, 3.2.3.-II và 3.2.3.-III)           

M

ước lượng của logarithm hoạt lực, trong định lượng đa chế phẩm M được dùng kèm với các kư tự UZ , ví dụ MU, để phân biệt giữa các chế phẩm

trung b́nh của một vài M độc lập

M’

logarithm tỷ lệ hoạt lực hay ước lượng của hoạt lực trước khi hiệu chỉnh với hoạt lực giả định

N

tổng số đáp ứng trong một định lượng

NS,NU

tổng số đáp ứng của chế phẩm SU

P

xác suất

QS…QZ

tương phản bậc hai của chế phẩm chuẩn và các chế phẩm thử

R

hoạt lực tính được – dùng với các kư tự đại diện cho chế phẩm thử để phân biệt giữa các chế phẩm trong một định lượng đa chế phẩm

R1…Rn

tổng đáp ứng của mỗi hàng (1 đến n) trong bố trí thí nghiệm h́nh vuông Latin, hay mỗi khối trong bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối

S

chế phẩm chuẩn

S

tổng đáp ứng của chế phẩm chuẩn

S1,S2,S3

tổng đáp ứng của liều thấp, trung b́nh và cao của chế phẩm S, trong một định lượng chỉ có 2 nồng độ của mỗi chế phẩm S2 đại diện cho nồng độ cao

T’

tổng đáp ứng trong một xử lư có giá trị bị mất

U…Z

tổng đáp ứng của các chế phẩm thử UZ

UZ

các chế phẩm cần định lượng

U1,U2,U3

tổng đáp ứng của liều thấp, trung b́nh và cao của chế phẩm U, trong một định lượng chỉ có 2 nồng độ của mỗi chế phẩm U2 đại diện cho nồng độ cao

X

ln(liều)

W

hệ số dùng trong phối hợp kết quả của các định lượng độc lập (phương tŕnh 4.2.1.-1)

                       



[1] V́ Bảng 3.2.4.-I không có f2 = 54, nên giá trị F tới hạn được tính bằng hàm FINV(p,f1,f2) của chương tŕnh Bảng tính Excel. Có thể tính các F tới hạn khác theo cách tương tự hoặc sử dụng các bảng tra cứu chi tiết hơn.